Інфікування збіжжя мікотоксинами

источник: Фузаріози культурних рослин. Монографія / В.В. Швартау, О.Л. Зозуля, Л.М. Михальська, О.Ю. Санін. – К.: Логос, 2016. – 164 с.

Мікотоксини продукуються багатьма видами грибів. При цьому мікотоксини видів Fusarium є одними з найбільш небезпечних для людини та свійських тварин.

Перелік мікотоксинів, що продукуються видами Fusarium, наведено в табл. 2.

Таблиця 2. Назви основних мікотоксинів, що продукуються видами Fusarium
Скорочена назваХімічна назва
A-DONАцетилдеоксиніваленол
DONДеоксиніваленол
DASДіацетоксисцирпенол
FUCФузарохроманон
FUS CФузарін C
FUS XФузаренон X
MASМоноацетоксисцирпенол
MONМоніліформін
NEOТеосоланіол
NIVНіваленол
ZEAЗеараленон
BEAUБоверицин

Проблема забруднення продукції сільського господарства мікотоксинами є глобальною. Наприклад, протягом 10 років у країнах ЄС експерти знаходили небезпечні мікотоксини у рослинницькій продукції (табл. 3).

Таблиця 3. Мікотоксини, що ідентифіковані у країнах ЄС у 2004–2013 роках (RASFF Annual Report, 2014)
Мікотоксини2004200520062007200820092010201120122013
Афлатоксини839946801705902638649585484341
DOM 104321148
Фумонізини142159213447
Охратоксин A27425430202734353254
Патулін 67 3
Зеараленон 162
Усього880996878760933669688635528410

В останні роки проводяться широкомасштабні дослідження з визначення як шляхів біосинтезу мікотоксинів, так і запобігання накопиченню небезпечних для людини та тварин кенобіотиків в урожаї [Foroud N.A., Eudes F., 2009; McCormick S.P. et al., 2011]. Автори детально розглядають шляхи синтезу мікотоксинів, зокрема класу трихотеценів (рис. 10).


Рис. 10. Основні шляхи синтезу мікотоксинів класу трихотеценів
[Foroud N.A., Eudes F., 2009; McCormick S.P. et al., 2011]

Таким чином, до трихотеценових мікотоксинів відносять хімічно споріднені сполуки загальною кількістю до 60, що належать до групи сесквітерпенових епоксидів. Вони є потенційними інгібіторами синтезу білка в еукаріотів. У той же час, вони представляють серйозну проблему для здоров’я людей і домашніх тварин [Joffe A., 1978; Foroud N.A., Eudes F., 2009; McCormick S.P. et al., 2011].

На підставі аналізу нуклеотидних послідовностей ДНК варіабельного регіону S-кінця великої ядерної рибосомальної ДНК (рДНК) (28S) трихотеценпродуценти роду Fusarium були розділені на 2 монофільні групи. Перша група включає в себе види F. accuminatum, F. sambucinum, F. tumidum, F. compactum, F. camptoceras, F. sporotrichioides і F. venenatum, які продукують трихотеценові мікотоксини типу А – Т-2, НТ-2, неосоланіол (NEOS) та діацетосцирпенол (DAS). До другої групи відносять види F. crookwellense, F. culmorum, F. graminearum, які продукують трихотецени типу В – фузаренон-Х (FUS), ніваленол (NIV) і дезоксиніваленол (DON). Автори вважають, що дані, отримані при вивченні рибосомальної ДНК, краще корелюють зі здатністю видів продукувати вторинні метаболіти, ніж з існуючою системою класифікації, заснованою на морфології грибків. Близько половини генів, що мають відношення до біосинтезу трихотеценів, ідентифіковані в геномному кластері Tri5 (за назвою гена, що кодує фермент триходіенсинтазу та є відповідальним за першу ключову ланку в метаболізмі ТМ). Згідно з останніми посиланнями, мікотоксини окремих видів роду Fusarium представлено у табл. 4.

Фактори, що лімітують накопичення трихотеценів у сформованому зерні після інфікування Fusarium, важливі для ефективних систем вирощування зернових колосових культур. В умовах кліматичної камери, після інфікування Fusarium culmorum ДНК, грибок знаходили лише у стеблах пшениці. Натомість, DON та його похідний DON-3-глікозид були знайдені у вищих частинах рослин. Після інфікування стебла накопичували DON у кількості більше 10 мг/кг маси сухої речовини рослини, а середні рівні DON після транслокації до колосу та оболонок досягали 1,9 мг/кг. Автори розглядають рівні метаболізації мікотоксину та його похідного, а також вперше визначають системи захисту зерна від забруднення мікотоксинами за ураження стебла на рівні інтерфейсу «зерно-членик колосового стрижня» [Winter M. et al., 2013; Stanciu O. et al., 2015].

Зміни клімату та домінування окремих мікотоксинів

В останні десятиліття, внаслідок зміни клімату, форм господарювання і технології вирощування сільськогосподарських культур, відбулася значна трансформація агробіоценозів, що призвело до суттєвих змін у патогенному комплексі збудників хвороб в умовах лісостепу України. Ряд провідних фахівців вважають, що спостерігається тенденція до зменшення кількості видів грибів – збудників фузаріозу колосу озимої пшениці. Частота ізоляції звичних збудників хвороби F. graminearum і F. culmorum поступово зменшується, а на домінуючі позиції виходять представники секції Sporotrichiella – гриби, які можуть розвиватися в посушливих умовах і синтезувати небезпечні трихотеценові мікотоксини [Ретьман С., Кислых Т., 2011].

Таблиця 4. Важливі види Fusarium, що інфікують зернові культури Європі, та основні мікотоксини, які вони продукують [Kotowicz N.K. et al., 2014;]
Види FusariumАгресивність до колосу зерновихЧастота ураження зерновихМікотоксини, що продукує вид Fusarium
F. avenaceum+++++висока моніліформін (MON), боверицин (BEAU), FUS C
F. cerealis++висока ніваленол, фузаренон, зеараленон
F. culmorum+++++висока деоксинівеленол, 3-ацетилдеоксинівеленол, 15-ацетилдеоксинівеленол, ніваленол, фузаренон, зеараленон (DON, ZEA, NIV, FUS X, FUS C, A-DON)
F. equiseti++сапрофіт фузарохроманон, зеараленон (ZEA), діацетоксискрипенол DAS, FUC
F. graminearum+++++висока деоксиніваленол, 3-ацетилдеоксиніваленол, 15-аце- тилдеоксиніваленол, піваленол, фузаренон, зеараленон (DON, ZEA, A-DON, NIV, FUS X, FUS C)
F. oxysporum++сапрофіт| моніліформін, фузарин
F. proliferatum++середняфумонізини, моніліформін, фузарин C
F. tricinctum++низькафумонізини, моніліформін, фузарин C
F. sporotrichioides++низькаT2-токсин, HT2-токсин, неосоланіол (NEO), DAS, FUS C, діацетоксисцирпенол (DAS), FUS, ZEN
F. poae+++середняDAS, MAS, NIV, FUS X, T2-токсин, HT2-токсин, FUS C, BEAU, Т2 тетраол
F. verticillioides++++середняфумонізини, моніліформін, фузарин C
M. nivaleне продукує мікотоксини

Разом з тим, у огляді Paula Kovalsky (2014) зазначається, що утворення мікотоксинів та контамінація продуктів рослинництва є глобальною проблемою. Вважається, що рівень інфікування залежить від двох головних чинників – рівня доступної вологи та температури. Протягом останніх років зміни клімату, що спостерігаються, зумовлюють і зміни циклів розвитку патогенів та зростання рівнів інфікування мікотоксинами. У літературі часто обговорюються проблеми зростання викидів СО2 й високої мінливості погодних умов, включаючи зміни в характері опадів з частими штормами.

Міжурядова група експертів зі зміни клімату (МГЕЗК) у доповіді 2014 року навела різні глобальні прогнози потепління, з сумарним прогнозом, що у 2100 році глобальна температура може підвищитися на 4,8°C. Зміни клімату вплинуть на сільське господарство не тільки через фізіологічну реакцію культур на підвищення температури, зміни в характері опадів і концентрацій СО2 в атмосфері, але й через ряд інших факторів. З одного боку, зміна температури і доступної вологи може вплинути на ефективність агрохімікатів, у т.ч. й фунгіцидів, з іншого – зміни клімату можуть змінити життєві цикли комах, які сприяють мікозам культурних рослин. Відомо, що деякі види грибів витісняються іншими більш вірулентними видами. Так, у звіті ФАО 2008 року відзначається, що у Північній Америці вид Fusarium culmorum замінюється суттєво більш вірулентним патогеном F. graminearum.

При аналізі забруднення рослинницької продукції мікотоксинами у світі та Україні знайдено високі рівні накопичення мікотоксинів (табл. 5) [Kovalsky Р., 2014; Rodrigues I. et al., 2012; Streit E. et al., 2012, 2013; Borutova R. et al., 2012].

Таблиця 5. Накопичення мікотоксинів у Східній Європі (Україна та Росія)
ПоказникиAflaZENDONFUMOTA
Кількість тестів3752543535
% тестів з перевищенням лімітів у накопиченні мікотоксинів2723564937
Середня величина вмісту (мкг/кг)420555212193

У роботах шведських дослідників 2009–2011 років встановлено, що види Fusarium poae та F. avenaceum були присутні майже в усіх зразках. Іншими широко розповсюдженими видами були F. graminearum та F. culmorum, які були присутні більш ніж у 70% зразків. Для ряду видів було знайдено низький рівень ДНК у 2011 році порівняно з іншими роками досліджень, але не для видів F. graminearum та F. langsethiae. Найбільш часто, в усіх зразках, зустрічався мікотоксин ENNs. Також часто зустрічався DON, особливо на ярій пшениці, тоді як ZEA та NIV зустрічалися в усіх зразках у 2009 році на пшениці озимій і менше у 2011 році на пшениці ярій. Тільки у 3-х зразках пшениці ярої знайшли мікотоксини T-2 чи HT-2 на рівні вище LOQ (межі кількісного детектування). Загальний вміст мікотоксинів був значно нижчим у 2011 році порівняно з іншими роками досліджень. Зворотна залежність встановлена для DON. Найбільш високі рівні кореляції між рівнем ДНК виду Fusarium та накопиченням мікотоксинів встановлено для F. avenaceum, ENNs (r2 = 0,67) та MON (r2 = 0,62), а також для F. graminearum та DON (r2 = 0,74). Результати робіт свідчать, що ряд видів Fusarium та мікотоксини одночасно детектуються в рослинах пшениці. Найбільші рівні мікотоксинів визначено для DON та ENNs, які належать до групи токсинів, поява яких пов’язана з інфікуванням видами Fusarium та які накопичуються у найбільших концентраціях [Lindblad M. et al., 2013].

Рівні мікотоксинів у рослинницькій продукції

Згідно з вимогами Національного стандарту України (ДСТУ 3768-2010 Пшениця. Технічні умови) законодавчо встановлено достатньо низькі можливі рівні вмісту фузаріозного зерна та мікотоксинів в урожаї пшениці (табл. 6–8).

У США законодавчо визначено [Grain Fungal Diseases and Mycotoxin Reference, 2006; Guidance for Industry and FDA, 2010] 1 ppm (мг/кг) DON у муці та інших продуктах, що можуть безпосередньо споживатися людиною, 10 ppm DON у зерні (за вмісту 88% маси сухої речовини), 10 ppm DON – для птиці, 5 ppm DON – для свиней та інших тварин.

Таблиця 6. Вибрані показники якості зерна м’якої пшениці за ДСТУ 3768-2010
ПоказникиХарактеристика і норма для м’якої пшениці за групами та класами
АБ6
12345
Сміттєва домішка, %, не більше ніж, зокрема:1,02,02,02,02,05,0
зіпсовані зерна0,30,30,50,30,51,0
фузаріозні зернау межах зіпсованих зерен
шкідлива домішка, зокрема:0,20,20,20,20,20,5
сажка, ріжки0,050,050,050,050,050,1
триходесма сиване дозволено
кожен з видів іншого токсичного насіння0,050,050,050,050,050,1
Сажкове зерно, %, не більше ніж5,05,08,05,08,010,0

Таблиця 7. Вибрані показники якості зерна твердої пшениці за ДСТУ 3768-2010
ПоказникиХарактеристика і норма для твердої пшениці за класами
12345
Сміттєва домішка, %, не більше ніж, зокрема:2,02,02,05,05,0
зіпсовані зерна, зокрема:0,20,20,51,01,0
фузаріозні зернау межах зіпсованих зерен
шкідлива домішка, зокрема:0,20,30,50,50,5
сажка, ріжки0,050,050,10,10,1
триходесма сива не дозволено кожен з видів іншого токсичного насіння0,050,050,050,050,1
Сажкове зерно, %, не більше ніж5,05,05,05,010,0

У Канаді рівні мікотоксинів у рослинницькій продукції для дитячого харчування визначено на рівні не більше 1,0–2,0 мг/кг для DON у м’якій пшениці. Згідно з Canadian Food Inspection Agency (CFIA) та Bureau of Chemical Safety, Food Directorate, Health Products and Food Branch, Health Canada регламентуються такі найвищі допустимі рівні багатьох мікотоксинів Fusarium у рослинницьких харчових продуктах, у тому числі діацетоксисцирпенолу, T-2 та HT-2 токсинів, ZEA, а також DON на рівні від 0,025 мг/кг для T-2 токсину для кормів молочного стада до 5 мг/кг для великої рогатої худоби та свиней [CFIA, 2012; Elliot B., 2015]. Зазначимо, що рівні мікотоксинів, що регламентуються фахівцями канадських офіційних органів, прийняті й у багатьох інших країнах. Відмінності в географічному розподілі різних трихотеценових мікотоксинів у пшениці та ячменю були вперше зареєстровані два десятиліття тому. Різні токсикологічні властивості деоксиніваленолу (DON), ніваленолу (NIV) та їх ацетильованих похідних вимагають ретельного контролю динаміки цих мікотоксинів та їх метаболітів. Концепція філогенії видів стала цінним інструментом для вивчення глобального виникнення мікотоксинів, що продукують види Fusarium. Ця концепція змінила погляди на перерозподіл трихотеценових мікотоксинів в екосистемах у контексті агрономії, кліматичних умов і впливу людини з боку світової торгівлі та обміну сільськогосподарськими товарами. Динаміка присутності різних видів трихотеценів видів Fusarium, а також їх хемотипів і генотипів на різних континентах суттєво різниться. З’ясовано, що не існує жодної монопопуляції, що жодна глобальна популяція не домінує, а окремі з них можна виділити, іноді навіть симпатрично у поєднанні з різними господарями. Збудники більш патогенних штамів і хемотипів можуть замінювати менш шкодочинні штами. Це, вірогідно, спостерігається за ненавмисної інтродукції нових генотипів у нові регіони: 3-ацетил-DON продукування F. graminearum у Канаді; 3-ацетил-DON продукування F. аsiaticum у Східному Китаї; 15-ацетил-DON – F. graminearum в Уругваї; NIV продукування F. аsiaticum у південній частині Сполучених Штатів [van der Lee T., Zhang H., Diepeningen A., Waalwijk C., 2015].

Таблиця 8. Максимально допустимий вміст мікотоксинів у зерні пшениці за ДСТУ 3768-2010
ПоказникНормаМетод контролювання
Мікотоксини, мг/кг
афлатоксин В10,005згідно з МР 2273, МР 4082, ДСТУ ЕN 12955
зеараленон1,0згідно з МР 2964
Т-2 токсин0,1згідно з МР 3184
дезоксиніваленон
(вомітоксин)
0,5згідно з МР 3940, МУ 5177
охратоксин А0,005згідно з ДСТУ ЕN ІSО 15141-1, ДСТУ ЕN ІSО 15141-2

Мікотоксини в агропродовольчих системах стали серйозною проблемою протягом останніх декількох десятиліть у Китаї, де Міністерство охорони здоров’я встановило мінімальні межі щодо вмісту мікотоксинів у різній агропродукції. Високі рівні DON були знайдені в пшениці, вирощеної в регіоні дельти Янцзи, яка більшою мірою зазнає впливу дощу, що підтримує інфікування видами Fusarium. В цілому, з усіх даних обстеження зроблено висновок про те, що 92% з проаналізованих зразків мали рівні мікотоксинів нижче китайських нормативних обмежень.

Таким чином, протягом останніх років відбувається посилення законодавчо регламентованих обмежень на вміст мікотоксинів у рослинницькій продукції в усіх країнах світу з потужним зерновиробництвом. Це потребує і вдосконалення методів з визначення мікотоксинів у збіжжі.

Сучасні методи визначення мікотоксинів, які продукуються видами Fusarium

З часу ідентифікації флатоксину у 60-х роках попереднього сторіччя було розроблено численні методичні підходи для визначення переважної більшості відомих сьогодні мікотоксинів.

Мікотоксини видів грибів Aspergillus, Penicillium, Fusarium і Alternaria є грибковими вторинними метаболітами, токсичними для хребетних тварин. Забруднення харчових продуктів і кормів для тварин мікотоксинами є проблемою в усьому світі. До головних напрямів зниження шкодочинності мікотосинів для хребетних тварин належать впровадження резистентних сортів/гібридів культурних рослин, шляхи інгібування систезу мікотоксинів у рослинах, використання хімічних та біологічних агентів для контролю збудників грибкових захворювань, контрольовані системи збирання та зберігання збіжжя, поліпшення умов сушки збіжжя, використання хімічних речовин (у т.ч. й природних) для зниження токсичності мікотоксинів, опромінення збіжжя для інгібування розвитку збудників грибкових захворювань. Велика робота в цій галузі була виконана для найбільш економічно важливих мікотоксинів – афлатоксину В1 і охратоксину. Набагато менше інформації доступно для інших небезпечних мікотоксинів, таких як трихотецин, фумонізини B1, зераленон, цитринін і патулін. Крім того, в останні роки запропоновано численні фізичні, хімічні та біологічні методи детоксикації, що використовуються для запобігання впливу токсичних і канцерогенних ефектів мікотоксинів. І, нарешті, дієтичні стратегії, які є одними з останніх підходів для протидії токсичності мікотоксинів та досягнення високих рівнів у ефективності зниження токсичної дії мікотоксинів за використання декількох зв’язуючих агентів (активоване вугілля, гідратований алюмосилікат кальцію, натрію, бентоніт, цеоліти та молочнокислі бактерії) [Kabak B. et al., 2006].

Якість зібраного зерна пшениці може помітно погіршуватися вже після збирання врожаю. Біотичні фактори, такі як тип зерна і ступінь зрілості, в поєднанні з важливими абіотичними факторами, такими як вміст води і температура, а також концентрація консерванту, будуть впливати на безпечне зберігання та рівень забруднення мікотоксинами. Ці мікотоксини включають деоксиніваленол (DON), що продукується до збору врожаю, та зеараленон (ZEA) – продукується у період після жнив збудниками Fusarium graminearum і Fusarium poae, а також, відповідно, охратоксин (OTA) від Penicillium verrucosum, що утворюється у післязбиральний період у холодних вологих північних європейських кліматичних умовах; й, можливо, T-2 і HT-2 токсини, які продукують Fusarium langsethiae. Це важливо, тому що погана сушка після збору врожаю та помилки при зберіганні збіжжя можуть погіршити рівень забруднення мікотоксинами, які були вже присутні до жнив [Magan N. et al., 2010].

Низькі законодавчо регламентовані рівні вмісту в зерні, що уражено хворобами, та накопичення мікотоксинів у рослинницькій продукції вимагають впровадження високотехнологічних систем вирощування основних сільськогосподарських культур.

Використання нанотехнологій для розвитку нанобіосенсорів є альтернативою у створенні високочутливих методів для експрес-виявлення мікотоксинів. Наноматеріали застосовуються для волокноподібних нанобіосенсорів, зокрема вуглецеві нанотрубки, нанопроволоки, наночастинки, квантові точки, нанострижні й нановолокна. Автори розглядають особливості застосування та відмінності у селективності нанобіосенсорів щодо різних мікотоксинів [Rai M. et al., 2015].

Відбір зразків зерна для визначення ураження мікотоксинами

Головною вимогою до якості проведення аналітичних досліджень є відтворюваність та висока точність детектування присутності збудників і мікотоксинів. Тому початок проведення аналітичних робіт – відбір зразків – повинен забезпечувати високий рівень відтворюваності результатів.

Встановлено, що у малих партіях зерна кукурудзи спостерігається висока варіабельність мікотоксинів, наприклад DON [Biselli S. et al., 2008]. Вміст мікотоксинів у зерні кукурудзи та інших зернових культур значно варіює та може суттєво відрізнятися від визначеного рівня у висівках [Sinha R.C., Savard M.E., 1997]. Розмол зерен перед детектуванням мікотоксинів суттєво зменшує варіабельність результатів аналізів [Champeil A. et al., 2004]. У відборах та підготовці зразків до аналізів необхідно зважити на те, що зростання об’єму зразка на аналіз суттєво зменшує рівень варіабельності детектування мікотоксинів [Whitaker T.B. et al., 2002].

Методи детектування та кількісного визначення мікотоксинів

Існує значна кількість методів детектування присутності збудників видів Fusarium та їх ідентифікації. У серії оглядів G.S. Shephard, F. Berthiller і колег та ряді інших на сайті http://www.wageningenacade mic.com/ розглядаються основні методи визначення присутності збудників фузаріозів. Звертається увага на необхідність якісної підготовки зразків та широке впровадження у світі методів з використанням LCICP-MS систем [Shephard G.S. et al., 2012; Berthiller F. et al., 2015].

Залежність розвитку збудників видів Fusarium від температурного та водного режимів вегетаційного сезону зумовлює активні розробки прогнозуючих моделей з передбачення ураження посівів пшениці в Аргентині, Бельгії, Канаді, Італії; у США та Європі – фузаріозом колосу та, відповідно, мікотоксинами [Prandini A. et al., 2009].

Хоча значна кількість моделей з передбачення контамінації пшениці мікотоксинами створена, валідовано та комерціалізовано лише поодинокі розробки, наприклад «DONcast», Канада [Schaafsma A.W. et al., 2007].

Методи скринінгу відрізняються швидкістю та скороченими витратами на аналізи. Багато методів скринінгу розроблено для використання у польових дослідженнях, проте вони продовжують використовуватися і у лабораторіях, особливо за потреби проаналізувати значні кількості зразків. Недоліком цих методів є потреба у системах стерилізації та приготування розчинів для екстракції. Тому більшість методів скринінгу побудовані на візуальній оцінці культурних рослин. Такий підхід достатньо ефективний за оцінки кількості уражених фузаріозом зерен у пшениці, тому що на цій культурі за ураження багатьма видами фузаріозів спостерігаються візуально ідентифіковані зміни форми та кольору зернини.

Ряд авторів вважають, що між візуально ідентифікованим ураженням зерен пшениці та вмістом мікотоксинів існує пряма кореляція, що дозволяє застосовувати методи візуальної ідентифікації для експрес-оцінки урожаю пшениці мікотоксинами DON [Tittlemier S.A. et al., 2013].

Різні методи доступні для виявлення мікотоксинів, але, на жаль, як наслідок їх обмеження за чутливістю та відтворюваністю, розробка нових і швидких методів є актуальною. З точки зору відносної простоти та оперативності проведення аналізів широко використовуються розроблені в останні роки імуноферментні аналізи, в основному через їх високу чутливість і простоту використання. Аналізи часто орієнтовані на одночасне ідентифікування багатьох мікотоксинів – афлатоксинів, охратоксину А, зераленону і деоксиніваленолу, з використанням мікрочипів для аналізів масивів, зокрема, кукурудзи, рису й арахісу [Selvaraj J.N. et al., 2015].

Суттєво підвищують ефективність детектування присутності збудників та мікотоксинів методи імунодіагностики ELISA і застосування підходів мультихвильового сканування уражених поверхонь [Meneely J.P. et al., 2011; Tittlemier S.A. et al., 2013]. До недоліків імунодетектування мікотоксинів слід віднести те, що, незважаючи на високу кількість відомих мікотоксинів, методи ідентифікування розроблено на відносно невелику частку домінуючих ксенобіотиків, наприклад для визначення DON, ZEA чи T-2/HT-2 [Meneely J.P. et al., 2011, 2012]. На сайті USDA наведено дані з відомих імуноферментних методів детектування мікотоксинів у рослинницькій продукції.

У літературі є відомості щодо некоректного визначення мікотоксинів імуноферментними методами, що пов’язано із завищенням результатів завдяки одночасному визначенню і метаболітів мікотоксинів. Наприклад, за визначення DON детектується одночасно і вміст 15-DON, що завищує отримані результати у 2–3 рази [Aamot H.U. et al., 2012].

У дослідженнях A. Wilson та колег ізоляти продуцентів трихотеценів типу А Fusarium sporotrichioides і Fusarium langsethiae були згруповані та диференційовані у філогенетичне дерево шляхом відмінностей у сиквенсі. Метою було розробити високочутливий ПЛР-аналіз для детектування Fusarium sporotrichiodes за присутності інших видів Fusarium на основі 5`-регіону гена tri5 gene. Проте цей метод не дозволяв відрізняти на достатньому рівні ізоляти Fusarium sporotrichioides та Fusarium langsethiae, що є підтвердженням генетичної спорідненості цих видів. Тому такий метод є надійним та відтворюваним ПЛР-аналізом присутності обох видів і може застосовуватися для детектування присутності обох видів на зерні [Wilson A. et al., 2004].

Створено імуноферментні методи одночасного детектування багатьох мікотоксинів [Dorokhin D. et al., 2011; Tittlemier S.A. et al., 2013, тощо].

Проблеми з коректним визначенням продуктів метаболізму грибів, у тому числі й видів Fusarium, можуть бути вирішені детектуванням присутності токсикантів методами LC-ICP-MS. При цьому точність визначення окремих мікотоксинів може досягати рівнів ppq [Vishwanath V. et al., 2009].

Впровадження нових систем ВЕРХ з мас-спектрометрією, наприклад у Agilent 6490, дозволяє досягти чутливості визначення мікотоксинів до рівня атограм (1 аг = 10–21 кг)

Високочутливим підходом до детектування забруднення мікотоксинами є молекулярний аналіз. Визначення ДНК-послідовності гена TRI12 кластеру TRI Fusarium використовується у ПЛР-аналізі у реальному часі для кількісної діагностики мікотоксинів 3-ADON, 15-ADON та NIV у генотипах F. graminearum і F. culmorum [Kulik T., Pszczolkowska A., 2011; Nielsen L.K. et al., 2011, 2012]. Цей метод використовує генетичні маркери, які безпосередньо задіяні у синтезі трихотеценів. Метод є ефективним та досить дешевим засобом детектування складу генотипу й змін у популяції збудника мікотоксиногенних видів Fusarium. В огляді Morcia та колег (2013) описано молекулярні методи визначення мікотоксинів різних видів Fusarium. Молекулярні методи та планарна спектроскопія застосовуються для детектування присутності мікотоксинів у зерні зернових культур та у борошні [Fredlund E. et al., 2010, 2013; Tittlemier S.A. et al., 2014]. Метод мультилокусного генотипування (MLGT) є потужним засобом точного ідентифікування видів та трихотеценових хемотипів значної кількості ізолятів Fusarium [Ward T.J. et al., 2002, 2008; Gale L.R. et al., 2011].

Останні розробки в галузі геноміки відкрили нові можливості для вивчення різноманітності та класифікації грибів. Представники роду Fusarium синтезують багато мікотоксинів, які інфікують різні сільськогосподарські культури. Ідентифікація видів Fusarium досі залишається одним з найбільш важливих питань у таксономії грибів, враховуючи, що число видів постійно змінюється протягом майже двох століть через різні таксономічні системи. Відомі сучасні молекулярні методи, такі як ампліфікація поліморфної ДНК, ампліфікації поліморфізму тощо, ДНК-мікрочипів, ДНК-штрихкодування і піросеквенування. Визначено цільові регіони в геномі, які можуть бути потенційними претендентами для генерації зондів та їх використання у філогенії Fusarium spp. [Chandra N.S. et al., 2011].

У дослідженні A. Llorens та колег детально, з точки зору морфології, фізіології та генетики, охарактеризовано ізоляти 44 видів Fusarium (5 Fusarium culmorum, 7 Fusarium graminearum, 1 Fusarium cerealis, 1 Fusarium poae, 26 Fusarium oxysporum та 4 комплекси видів Gibberella fujikuroi). Показано, що ізоляти F. graminearum, F. culmorum та F. cerealis продукували високі рівні мікотоксинів ZEA та трихотеценів типу В, ізолят F. poae продукував низький рівень ніваленолу, а F. oxysporum та комплекс ізолятів G. fujikuroi не показали цієї здатності. Рестрикційні карти регіону IGS виявили взаємозв’язок між господарем, географічним походженням ізоляту та здатністю продукувати мікотоксини. Проте отримані за допомогою 6-ти ензимів рестрикції (CfoI, AluI, HapII, XhoI, EcoRI і PstI) гаплотипи дозволили відокремити 6 проананалізованих видів Fusarium. Таким чином, ця швидка та зручна методологія дозволяє групувати генетично близькі штами та визначати генетичні взаємозв’язки між групами [Llorens A. et al., 2006].

Ми провели польові обстеження колекції сортів озимої пшениці в ПрАТ «Агрофорт» (Кагарлицький район Київської області) й відібрали проби рослин. За метеоданими, у регіоні проведення досліджень 2015 рік був не сприятливий для розвитку збудника фузаріозу пшениці.

Дослідження проводилися в польових та лабораторних умовах. Для визначення колосової інфекції було відібрано понад 150 зразків з усіх областей України, які пророщували в рулонах за температури 25°С. На 7-й день визначали відсоток уражених рослин різними типами хвороб, джерелом інфекції яких є насіння. В подальшому проводили мікроскопічний аналіз за допомогою оптичного мікроскопа.

Рослини, які мали явні ознаки ураження фузаріозом, у подальшому аналізували за допомогою ПЛР-аналізу для визначення видового складу грибів Fusarium spp. та типів мікотоксинів.

Також восени було відібрано понад 150 зразків рослинного матеріалу озимої пшениці з ознаками ураження кореневими гнилями з різних областей України. Відбір проводили двічі: на початку вегетації та перед входом у зимівлю. В подальшому ці зразки також аналізували ПЦР-методом для визначення видового складу грибів Fusarium spp.

Для виявлення ступеня ураження використовували аналіз ІФА. Для аналізу з кожного зразка брали 50 г насіння або 100 г рослинного матеріалу, з яких виділяли ДНК згідно зі стандартною методикою ПЦР та виробників тест-систем. Для роботи використовували тест-системи для F. graminearum, F. culmorum, F. sporotrichioides, F. langsethiae, F. poae, F. avenaceum, F. tricinctum, F. cerealis. Результати ампліфікації зчитувалися та зберігалися за використання системного забезпечення Image Lab.

Дослідження з визначення ефективності препаратів проводили на дрібних дослідних ділянках ТОВ «Сингента» та Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за стандартною методикою у 4–6-кратній повторності. Усі варіанти були розміщені рендомізовано.

Аналітичні дослідження проводили в діагностичних лабораторіях у Білій Церкві, Харкові, Хмельницькому та Одесі. Для аналізу використовували фрагменти колосків.

Для посилення ступеня ураження використовували штучне зараження F. graminearum. Математичну обробку одержаних результатів проводили за Доспєховим (1985) з використанням програми Microsoft Excel.

У зернівках і лусочках колосу зразка NS-40S було виявлено генетичний матеріал фітопатогенного гриба F. poae та грибів, що продукують мікотоксини з груп NIV, FUSX, T-2, HT-2, DAS, ZEA. У зернівках та лусочках колосу зразка Самурай 1 було виявлено генетичний матеріал фітопатогенних грибів F. langsethiae, F. poae, F. tricinctum та грибів, що продукують мікотоксини з груп NIV, FUSX, T-2, HT-2, DAS, ZEA; T-2, HT-2, DAS, ZEA і MON, BEA, ENN (табл. 9).

Таблиця 9. Результати ПЛР-діагностики з визначення присутності збудників фузаріозу на сортах пшениці озимої
(ПрАТ «Агрофорт», Кагарлицький р-н, Київська обл., 2015 р.)
СортF. graminearumF. culmorumF. sporotrichioidesF. langsethiaeF. poaeF. avenaceumF. tricinctum
NS-40S+
Самурай 1+++
Самурай 2+
Сейлор
Фаворитка++
Актор++
Глаукус++++
Смуглянка++
Примітки: «+» – наявність генетичного матеріалу фітопатогенного гриба,
«–» – відсутність генетичного матеріалу фітопатогенного гриба.

У зернівках і лусочках колосу зразка Самурай 2 було виявлено генетичний матеріал фітопатогенного гриба F. poae та грибів, що продукують мікотоксини NIV, FUSX, T-2, HT-2, DAS, ZEA. У зернівках і лусочках колосу зразка Фаворитка було виявлено генетичний матеріал фітопатогенних грибів F. langsethiae, F. poae та грибів, що продукують мікотоксини NIV, FUSX, T-2, HT-2, DAS, ZEA та T-2, HT-2, DAS, ZEA. У зернівках і лусочках колосу зразка Актор було виявлено генетичний матеріал фітопатогенних грибів F. sporotrichioides, F. poae та грибів, що продукують мікотоксини NIV, FUSX, T-2, HT-2, DAS, ZEA та T-2, HT-2, DAS, ZEA. У зернівках і лусочках колосу зразка Глаукус було виявлено генетичний матеріал фітопатогенних грибів F. graminearum, F. sporotrichioides, F. poae, F. avenaceum та грибів, що продукують мікотоксини DON, 3-ADON, 15-ADON, NIV, FUSX, ZEA; NIV, FUSX, T-2, HT-2, DAS, ZEA; T-2, HT-2, DAS, ZEA та MON, BEA, ENN. У зернівках і лусочках колосу зразка Смуглянка було виявлено генетичний матеріал фітопатогенних грибів F. graminearum, F. poae й грибів, що продукують мікотоксини NIV, FUSX, T-2, HT-2, DAS, ZEA. У зернівках та лусочках колосу зразка Сейлор не було виявлено генетичного матеріалу фітопатогенних грибів роду Fusarium та грибів, які продукують мікотоксини.

Проведено також дослідження щодо залежності урожайності озимої пшениці від наявності фузаріозу (табл. 10).

Таблиця 10. Урожайність та наявність збудників фузаріозу озимої пшениці
(ПрАТ «Агрофорт», Кагарлицький р-н, Київська обл.)
СортНаявність збудників фузаріозу на озимої пшениціУрожайність, ц/га
NS-40S+79,0
Самурай 1+78,8
Самурай 2+78,0
Сейлор86,0
Фаворитка+79,0
Актор+80,0
Глаукус+77,0
Смуглянка+79,0

За результатами проведених досліджень можна зробити висновок, що розвиток захворювання фузаріозу озимої пшениці має великий вплив на її урожайність.

Поделиться: