Генетика устойчивости растений и вирулентности патогенов:
Молекулярно-генетические основы устойчивости растений и вирулентности патогенов

автор:

Разнообразие маркирования генетического материала в настоящее время достаточно велико, но в последние десятилетия очевидное преимущество получили молекулярные маркеры различных первичных последовательностей ДНК. Молекулярные маркеры, основанные на полиморфизме фрагментов ДНК и белков, позволяют успешно решать целый ряд задач: создания генетически обоснованных схем последовательной гибридизации различных форм растений; вопросов взаимодействия ядерного и цитоплазматических геномов; отбора и воспроизводства ценных генотипов; выявления хозяйственно-ценных и сортоспецифических ассоциаций генов, обусловливающих генетико-популяционную адаптацию к биотическим и абиотическим стрессам; сохранения генофондов растений; целенаправленной интрогрессии генетического материала от диких видов; регистрации и охраны авторских прав при создании сортов.

Качественный скачок в решении задач картирования геномов растений, маркирования главных генов количественных признаков, выявления сортоспецифических особенностей генофондов растений, а также популяционно-генетических механизмов адаптации к локальным условиям разведения появились в связи с обнаружением гигантского полиморфизма на уровне фрагментов ДНК, в частности, микросателлитов и разработкой доступных методов анализа этого полиморфизма. Все это позволяет прогнозировать возрастающую роль молекулярных маркеров в решении задач селекции, семеноводства, сохранения биоразнообразия растений (19).

Основанные на ДНК молекулярные маркеры начали привлекать внимание в конце 70-х после того, как Southern показал, как найти „специфические последовательности среди ДНК-фрагментов, разделенных гель-электрофорезом“. Другими словами, последние 20 лет показали, что ДНК-анализ трансформировался и стал широко применяться для удовлетворения различных потребностей человека и в медицине. В настоящее время молекулярные маркеры находят широкое применение в селекции растений, в первую очередь, в США (кукуруза, соя). В Европе эта работа проводится слабее. Одним из потенциальных препятствий для связей между селекционерами и генетиками может быть ставящее в тупик изобилие маркерных типов.

Краткое описание некоторых молекулярных маркёров (7)

1.PCR (polymerase chain reaction) — полимеразная цепная реакция (ПЦР) заключается в избирательном синтезе in vitro большого числа (порядка млн.) копий небольшого размера матричной ДНК размером от 5 до нескольких тысяч нуклеотидов; при некоторых условиях возможна амплификация более крупных размеров (до 35 тыс. п. о.). Метод амплификации in vitro с помощью ДНК-полимеразы нуклеотидных последовательностей с использованием олигонуклеотидных ДНК-затравок, комплементарных последовательностям противоположных цепей ДНК на границах амплифицируемого участка. ПЦР представляет собой серию из трех циклически повторяющихся реакций (20—30 циклов) — денатурация ДНК, отжиг ДНК-затравок и синтез ДНК с каждой из затравок навстречу друг другу с использованием противоположных цепей ДНК в качестве матриц. По завершении каждого цикла количество синтезируемого продукта удваивается и происходит увеличение количества анализируемой последовательности. ПЦР позволяет амплифицировать любые последовательности, что делает возможным использовать её для секвенирования, молекулярной ДНК диагностики, картирования генов и др.

2. AP-PCR (arbitrarily primed polymerase chain reaction) — полимерная цепная реакция с произвольными праймерами. Модификация стандартного метода ПЦР, позволяющая осуществлять амплификацию целевых последовательностей ДНК с помощью предварительного знания нуклеотидных последовательностей данного генома. Метод позволяет выявить полиморфизм бактерий, грибов и растений.

3. QTL (quantitative traits loci) — локусы количественных признаков (ЛКП) — комплексная генетическая система, включающая группу полигенов. Показано, что такая система может быть достаточно четко локализованной и компактной и, вероятно, представлена в геномах высших организмов как цельная единица.

4. AFLP (ampliphycation fragment lengh polymorphism) — полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (ПДАФ). Новый класс маркёров, обладающих важным преимуществом перед остальными типами ДНК маркёров — для их использования не требуется знать ни первичную последовательность, ни специфические праймеры. Метод включает в себя три этапа: рестрикцию и связывание с затравками, PCR-амплификацию и анализ геля. На первом этапе геномная ДНК режется рестриктазой. Олигонуклеотидный „адаптер“ связывается с фрагментами так, что адаптер и несколько оснований на конце фрагмента (сайт рестрикции) служит универсальной мишенью для амплификации фрагментов. PCR-амплификация с такой мишенью приведет к амплификации всех возможных фрагментов. Для того, чтобы избежать нежелательной сложности спектров, праймер выбирается на основе „универсального“ праймера плюс несколько произвольных оснований на 3` — конце, так что амплифицируются только фрагменты с теми же основаниями.

5. RFLP (restriction fragment lenth polymorphism) — полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Изменчивость размеров фрагментов ДНК, выщепляемых рестриктазами, обусловленная возникновением или изменением в результате мутаций сайтов рестрикции. Анализ ПДРФ позволяет использовать отдельные аллели в качестве популяционных маркёров, а также применять их в пренатальной и обычной диагностике мутаций в генах и определять их локализацию в геноме методом рестрикционного картирования. Анализу и сравнению подлежат гомологичные фрагменты геномной, эписомной и иной ДНК размером до 30—40 тыс. п.о., иногда — до нескольких млн. п. о. Полиморфизм обусловлен изменениями в ДНК, приводящими к появлению (исчезновению или изменению взаиморасположения) сайтов узнавания для рестриктаз и выявляется методами рестрикции, гель-электрофореза и блот-гибридизации. Проблемы гомологичности сравниваемых ДНК обычно не возникает.

При анализе ПДРФ возможно появление большого количества продуктов рестрикции, в связи с чем фрагменты ДНК переносят из геля на твердую подложку и гибридизируют с меченой пробой ДНК, гомологичной тестируемым последовательностям. Гибридизационные фрагменты типируют с помощью радиоавтографии. В качестве гибридизационных проб используют к-ДНК, или фрагменты геномной ДНК с известной функцией, относительно часто используют различные семейства повторяющихся последовательностей ДНК. В случаях, когда эти повторы состоят из простой последовательности — „минисателлитной ДНК“, использование их в качестве зондов для гибридизации позволяет получить высокоспецифическую картину гибридизации геномной ДНК, характерную для конкретной особи. Этот принцип получил название „метода геномной дактилоскопии“ или „фингерпринта“ — отпечатка пальцев. Минисателлитные зонды удобны для маркирования изменчивости генетического материала у разных организмов. ПДРФ — широко распространенное явление. Соответствующие аллельные варианты могут быть использованы как маркёры отдельных сегментов хромосом и локализованных в них тесно сцепленных генов, некоторые из которых могут кодировать полезные признаки, в первую очередь, устойчивость к патогенам. ПДРФ эффективен при картировании генома, маркировании генов многих биологических и экономически важных признаков. Использование ПДРФ позволило в короткие сроки существенно заполнить генетические карты различных видов растений и других организмов.

К недостаткам ПДРФ, ограничивающих возможности его применения в исследованиях на популяционном уровне относятся следующие: 1) необходимо обеспечение ДНК-зондами для получения достоверных различий на внутривидовом уровне и исследования их подходящих комбинаций, прежде чем скрининг разнообразия может быть проведен; 2) требуется относительно большое количество высокоочищенной ДНК; 3) неполная пенетрантность аллелей, контролирующих признаки продуктивности; 4) наличие изменчивости негенетической природы; 5) трудности локализации аллелей структурного гена.

6. RAPD (random amplified polymorphic DNA) — произвольно амплифицированная полиморфная ДНК — продукт ПЦР с произвольными праймерами. Праймеры, применяемые для RAPD, имеют относительно небольшие размеры (8—12 нуклеотидов), произвольную нуклеотидную последовательность и [G+C]-состав не ниже 50%. При этом отпадает необходимость выяснения нуклеотидной последовательности амплифицированного участка ДНК, что значительно упрощает анализ. Образцы электрофоретического разделения амплифицированной ДНК (RAPDs) из различных генетических источников могут быть объектом сравнительного анализа, на основании которого определяется уровень генетического сходства.

Anna Schneider (74) в 1997 году от имени АЕР (Европейская ассоциация по исследованию зерновых бобовых культур) провела опрос среди селекционеров Европы (частных) об использовании ими молекулярных маркеров в селекции. Из 17 ответивших 12 показали, что они используют молекулярные маркеры в селекции, в т. ч. 4 в селекции зерновых бобовых культур: гороха, кормовых бобов и сои.

Были использованы методы анализа: RAPD, AFLP, PCR, изоэн-зимный, микросателлиты. В связи с дороговизной ДНК-методов по сравнению с классическими методами анализа селекционного материала приоритетной целью использования молекулярных маркеров селекционеры считают устойчивость к болезням.

RFLP анализ был использован для характеристики рас Fusarium oxysporm f. sp. pisi, вызывающих закупорку сосудов у гороха (80). Ранее были идентифицированы 4 расы — 1, 2, 5 и 6 при испытании серии сортов — дифференциаторов гороха. Недавно новый вариант расы 6, охватывающий 3 штамма был идентифицирован в Дании.

При помощи метода RFLP анализировали 3 пробы ДНК из расы 1 гриба. Две пробы содержали ДНК с умеренными повторами, третья содержала рибосомальную ДНК с повторами. Изоляты рас 1, 2 и 5 были успешно опознаны, хотя изолят расы 6 был неотличим от расы 1. Раса 2 была разделена на 2 субгруппы — 2а и 2в. В целом процесс от изоляции грибов и растения до получения результатов был выполнен за 10 дней в сравнении с 6 неделями для проведения стандартного теста по патогенности (Whitehead et al., 1993, цит. 80).

11 патогенов ложной мучнистой росы (Peronospora viciae (Berk) Casp.), идентифицированные на 4 сортах — дифференциаторах гороха, могут служить базой для молекулярно-генетических исследований генов, ответственных за взаимодействие „сорт - патотип“.

Взаимодействие между генотипами гороха и Pseudomanas syringae pv. pisi (бактериоз гороха) также представляет удобную модель для молекулярно-генетических исследований природы патогенеза и специфичности хозяина в связи с наличием сортов с четко определенной реакцией на определенные расы.

Изоляты Ps. syringae pv. pisi могут быть сгруппированы в различные расы на основе их взаимодействия с сортами — дифференциаторами: недавно 8 рас было идентифицировано по их взаимодействию с 8 сортами — дифференциаторами (79). Теория Флора „ген-на-ген“ предполагает, что специфичность контролируется парой генов хозяина и паразита и в большинстве случаев проявляется во взаимодействии доминантного гена устойчивости (R) хозяина с доминантным геном вирулентности (А) патогена, преодолевающего устойчивость растения. В случае взаимодействия P. syringae pv. pisi с горохом реакция устойчивости быстрая, локализованная, некротический коллапс ткани со стороны инокуляции обозначен сверхчувствительной реакцией. В табл. 1.1 приведена расовая структура, основанная на теории Флора и предполагающая 5 пар генов устойчивости.

Конструкция Генной Библиотеки

Устойчивость растений к патогену является следствием взаимодействия генов хозяина и паразита и возникает только тогда, когда растение содержит специфический аллель гена устойчивости (R-гена), продукт которого распознаёт патоген, имеющий соответствующий аллель авирулентного гена (avr-гена). Все другие комбинации R- и avr-генов не мешают развитию болезни. Такой тип устойчивости контролируется моногенно, а патоген и его хозяин обычно имеют одинаковые географические центры происхождения и эволюционируют параллельно (16, 78). Однако, молекулярная природа „ген-на-ген“ взаимодействия до 1992 года не была известна и изучена.

Гены устойчивости у растений — R-гены. В настоящее время известны последовательности более, чем у 20 R-генов: они определяют устойчивость к различным типам патогенов (вирусы, бактерии, грибы, животные), а их сходство свидетельствует об одинаковой природе возникновения сигнальных событий при формировании защитной реакции. Все эти гены сгруппированы в 5 классов (16, 78). Разнообразие R-генов напрямую связано с их геномной организацией. Различные R-локусы могут находиться в одном из четырёх состояний. Первые имеют один ген с множеством аллелей. Например, L-локус растений льна обладает 13 аллелями, определяющими устойчивость к различным расам М. lini (16). Другие R-локусы могут существовать как однокопийный ген, который присутствует в устойчивых линиях и отсутствует в восприимчивых, например Rpml-ген у арабидопсиса. У многих растений R-локус имеет тандемные повторы тесно сцепленных гомологичных R-генов с различной спецификой. Наконец, в отдельных районах генома R-гены для грибных, бактериальных и вирусных патогенов локализованы на хромосоме на очень близком расстоянии друг от друга (1—2 см). Так, у арабидопсиса выявлено пять R-ген-богатых районов. Такие ассоциации R-генов называются главными комплексами устойчивости (MRCs — major resistance complexes) (45).

Гены авирулентности патогена — Avr-гены Для выявления специализированного ответа растений требуется идентификация не только растительных R-генов, но и генов авирулентности паразита, контролирующих синтез расоспецифического элиситора.

У грибов элиситорами являются, как правило, богатые цистеином пептиды (45). Это отмечено для продукта гена NIPI у Rhynchosporium secalis и продукта гена Avr9 (Cladosporium fulvum), который состоит из 28 аминокислот и предположительно образует компактную структуру с тремя дисульфитными связями. Продукт последнего вызывает реакцию сверхчувствительности у растений томата (ген Cf9), причём ген Avr9 контролирует синтез препротеина, который в случае взаимодействия с грибными и растительными протеазами разлагается до олигопептидов небольшого размера. Элиситор, кодируемый геном Avr4 того же патогена, имеет 88 аминокислот. Возможно, цистеину принадлежит решающая роль в авирулентности грибов, т.к. при замене некоторых цистеинов на тирозин в гене Avr4 гриб C.fulvum приобретает способность заражать растения томата, несущие ген Cf4.

Для патогенных бактерий описано несколько типов avr-генов. Например, у P. syringae p. v. tomato ген avrD, локазизованный в плазмиде, кодирует гликозилтрансферазу, участвующую в синтезе элиситора сиринголида, который индуцирует реакцию сверхчувствительности у растений сои (Glycine soja L.), несущих ген Rpg4 (16). Для растительных вирусов известно, что генами вирулентности могут быть гены, отвечающие за структуру и химический состав их оболочки, кодирующие синтез репликазы, или гены, контролирующие синтез белка и перемещение вируса.

Генная библиотека Pisum sativum и его патогенов Подход, разработанный Staskawicz et al. (78) был использован для клонирования авирулентных генов. Он включает конструкцию генной библиотеки в хозяинный космидный клонируемый вектор, pLAFR3 и их интродукцию в другие расы, которые затем могут быть отобраны на соответствующих сортах гороха для узнавания специфичности гена А. Расы Pseudomonas syringae pisi значительно различаются между собой по их способности наследовать плазмиды такого же типа, как космидный вектор. Штамм 299А расы 1 был выбран как реципиент, дающий возможность контротбора донора — это необходимо для получения спонтанного рифампицин-устойчивого мутанта.

Такие мутанты варьируют широко, но сохраняют патогенные характеристики в потомстве.

Требуется точная оценка размеров генной конструкции для того, чтобы определить число клонов, требующихся для представительной библиотеки. Точных данных для P. syringae pisi нет, но для родственных грибов получены оценки на основе PFGE-анализа (гель-электрофорез): P. aeruginose — 5933 kb; P. tolaasii — 6720 kb; P. putida — 6920 kb; P. solanacearum — 4925 kb; P. syringae pv. glycinea — 3270 kb (81).

Авирулентный ген А2 расы 2 P. s. Pisi

Гипотетически можно полагать, что ген А2 присутствует в расе 2 и отсутствует в расе 1. Последовательно некоторые из 1100 клонов были коньюгированы в реципиентном штамме расы 1 и инокулированы в сорт гороха Early Onward, содержащий единичный ген устойчивости R2. Единичный клон, обозначенный pAV270, несовместимый с сортом Early Onward, но совместимый с сортом Kelvedon Wonder подтвердил специфичность клонированной ДНК. Для подтверждения природы специфичности взаимодействия „ген-на-ген“ 2 сорта гороха были скрещены и потомство F2 анализировали по расщеплению по устойчивости к расе 2 и к расе 1, содержащей pAV270. Эти эксперименты дали определенные доказательства специфичности авирулентного аллеля, включенного во взаимодействие „ген-на-ген“ у патоваров P. syringae.

Таблица №1.1
Взаимодействие „ген-на-ген“ между сортами гороха и расами Pseudomonas syringae pv. pisi, подтвержденное генетическим анализом по Vivian A.
Сорта горохаГены устойчивостиРасы с их генами авирулентности
1 2 3 4 5 6 7 8*
.3.4 2... 3... 4... 2.4.5 ... 2.3.4 1..4
Kelvedon Wonder ........ + + + + + + + +
Early Onward 2...... + - + + - + - +
Belinda ..3..... - + - + + + - +
Hurst Green-shaft 1..4.... - + + - - + - -
Partridge 1.345... - + - - - + - -
Sleafor Triumph ?2.4?... - - + - - + - -
Vinco 123..... - - - + - + - -
Fortune 12345... - - - - - + - -
* — генетически модифицированный штамм из расы 1;
+ — совместимый (восприимчивый);
- — несовместимый (устойчивый);
? — неустановленный;
. — отсутствие гена устойчивости или авирулентности.

Функциональные гомологи (обозначенные avrPma.A1 из штамма m2 и avrPmaA2 из штамма 791) были клонированы из P. syringae pv. maculicola, каждый из них показал идентичный фенотип P. syringae pv. pisi, взятый с сортов гороха. Анализ последовательностей показал, что два гомолога идентичны друг другу и 97% нуклеотидных последовательностей идентичны штамму avrPpiA1. Все 3 гена, интродуцированные в P. syringae pv. phaseolicola, проявили авирулентность по отношению к сорту фасоли Canadian Wonder и задерживали реакцию сверхчувствительности у P. syringae сорта Seaferer. Интродукция трех генов в вирулентный штамм m4 pv. maculicola показала, что они идентичны экотип-специфичности Arabidopsis thaliana.

Подобные наблюдения авирулентных генов открывают заманчивые возможности того, что соответствующие гены устойчивости гороха и фасоли могут показать некоторую структурную идентичность гену RPM1 A. thaliana.

Теория „ген-на-ген“ рассматривает противостояние единичных генов авирулентности и устойчивости и из этого может следовать, что ген avrPpiAl гомологичен генам у всех трех хозяев-растений. Сравнительно маленький размер генома A. thaliana (70000 kb) удобен для изоляции RPM1 и поиска гомологии у гороха и фасоли или его использования в иммунологической пробе для обнаружения соответствующего продукта R-гена у растений-хозяев. Однако, это не означает, что авирулентный ген противостоит только одному типу гена устойчивости: как будет показано ниже, уже известно, что avrPpiA1 взаимодействует с двумя генами устойчивости фасоли (37, 40).

Авирулентный ген A3 расы 3 P. s. Pisi

В более ранней работе сделана попытка изолировать непатогенный мутант, используя транспозон Тn5. Это привело к изоляции мутанта расы 1, названного PF24, который потерял одну из двух плазмид, имеющихся у родительского штамма 299 А (76).

Впоследствии, Bavage et al. (1991, цит. 81) показали, что потеря плазмиды в PF24 связана с потерей авирулентности по отношению к сорту гороха Belinda, который обладает геном устойчивости R3. Это дало возможность клонирования второго авирулентного гена из P. s. pisi, который обозначен avrPpiB1 и соответствует гену A3, изолированному из расы 3. Эти исследования приводят к важному заключению о том, что функции сверхчувствительности и патогенности гороха имеют плазмидную природу.

Специфичность нехозяинной устойчивости

Сортоспецифический авирулентный ген avrPpiA1 из P. s. pisi может также очевидно взаимодействовать с генами устойчивости Phaseolus, при его переносе в P. s. phaseolicola. Этот путь интересен для передачи новых авирулентных генов от одного патовара другому. Это будет включать скрининг на совместимом сорте соответствующего хозяина, т.е. генная библиотека от pv. phaseolicola будет передана pv. pisi и продемонстрирована на универсально восприимчивом сорте Kelvedon Wonder. Этот подход был испытан и все 7 клонов из библиотеки расы 4 P. s. phaseolicola были авирулентны по отношению к гороху (81). 5 из этих клонов показали некоторую степень гомологии ДНК и различные реакции на сортах гороха. В работах с другими родственными бактериальными патогенами показано, что гены, включенные в сортовую специфичность, могут также быть включены в нехозяинную устойчивость и это еще раз демонстрирует взаимодействие „ген-на-ген“.

Картирование генов устойчивости к вирусам у гороха может иметь значение для последующей изоляции и клонирования полезных генов для селекции. Так, единичный рецессивный ген в группе сцепления 2 контролирует устойчивость к вирусу мозаики гороха и тесно сцеплен с другими рецессивными генами устойчивости к вирусу желтой мозаики фасоли (BYMV), вирусу жилки клевера (CYVV), чечевичному штамму PSbMV и вирусу обыкновенной мозаики фасоли (BCMV-NL8). Другой кластер рецессивных генов устойчивости к PSbMV и CYVV локализован на хромосоме 6.

С точки зрения Fraser и Gertwitz (1987) рецессивные гены устойчивости означают отсутствие некоторых факторов в устойчивом растении, которые требуются для патогенеза (негативная модель); однако, многие единичные гены устойчивости к вирусам являются доминантными (позитивная модель).