Способы заражения растений:
Создание искусственных инфекционных фонов в поле

автор:

Для создания в полевых условиях искусственного инфекционного фона почвообитающих возбудителей болезни (Fusarium, Pythium, Sclerotinium, Rhizoctonia) применяют метод монокультуры восприимчивого растения-хозяина в течение нескольких лет. Накопление инфекции можно ускорить искусственным заражением почвы путём внесения растительных остатков или почвы с участков, на которых отмечено эпифитотийное развитие заболевания. Размноженную на питательных средах чистую культуру патогена можно внести на поле при посеве и два — три раза в течение вегетационного периода. Последний приём применяется не только для почвообитающих грибов, бактерий и нематод, но и для зимующих стадий факультативных и облигатных паразитов.

В вегетационных и лабораторных условиях стерилизованную почву перед посевом смешивают с чистой культурой возбудителя фузариоза, размноженной на стерильных семенах овса или растения-хозяина.

Другой способ эффективного заражения — намачивание проростков с травмированными корешками в гомогенате чистой культуры патогена в течение 1 часа перед посевом семян в вегетационные сосуды или ящики со стерильной почвой. Ниже приводятся примеры создания искусственных инфекционных фонов для различных зерно-вых бобовых культур в селекционных центрах ряда стран.

Фузариозный фон гороха. В НИИСХ ЦЧП им. В.В. Докучаева изучали различные способы создания фузариозного инфекционного фона для испытания сортов гороха.

      Были изучены варианты:
  • посев летом при температуре почвы 18—20°С, т. е. оптимальный для развития возбудителя болезни;
  • выращивание сортов гороха в монокультуре;
  • внесение патогена с семенами гороха при посеве;
  • внесение культуры возбудителя болезни в почву перед посевом.

Контролем служил сорт, посеянный в оптимальный срок по принятой в регионе технологии возделывания.

Культуру возбудителя выращивали на стерильных семенах овса и гороха в соотношении 2:1 и после 18—20 дней инкубации подсушивали в тени при температуре не выше 25°С, затем размалывали на электрической мельнице и полученный препарат вносили в почву из расчета 100 г/м².

Наиболее достоверные результаты в течение трех лет (1976—1978) были получены в варианте 4 (внесение культуры патогена в почву перед посевом), который впоследствии и был принят за основу. При этом осенью перед обработкой почвы вносят измельченные больные растения, а весной перед культивацией — 100 г/м² возбудителя в условиях монокультуры в течение ряда лет. Для контроля за равномерностью распределения инфекционной нагрузки через каждые 5—10 делянок высевали восприимчивый сорт, по степени поражения которого судили о выравненности фона.

Шевченко и Кирпичева разработали и применяют следующую методику создания фузариозного фона для гороха. Чистую культуру F. oxysporum выделяли на картофельно-глюкозной агаровой питательной среде. Затем по 100 г семян овса помещали в химические стаканчики объёмом 800 мл, заливали 100 см3 воды и стерилизовали в автоклаве под давлением 2 атм. в течение 1 часа. После остывания зерно встряхивали и в стерильных условиях высевали на него суспензию культуры гриба. Через 15 дней появлялась плотно сплетенная грибница. Затем готовую культуру извлекали из стаканов, рассыпали тонким слоем (до 3 см) и просушивали на воздухе. Перед посевом гороха в почву вносили инфицированное зерно овса из расчета 150 г/м². В течение вегетационного периода влажность почвы поддерживали на уровне 80% путем орошения.

Польский исследовательский центр по испытанию сортов гороха в течение трёх лет, начиная с 1990 года, провел полевые и вегетационные эксперименты по оценке уровня устойчивости 60 сортов гороха к фузариозному увяданию (F. oxysporum) и корневым гнилям (F. solani, F. culmorum). Инокулюм для инокуляции готовили из 10—12 изолятов трех видов Fusarium (Fo, Fs, Fc). Культуру каждого изолята гриба выращивали на среде, содержащей семена гороха, перлит и воду в соотношении 1:1:2/3 в течение трех недель при комнатной температуре. Колбы регулярно встряхивали во избежание образования комков. Когда среда полностью покрылась мицелием гриба, изоляты смешали и использовали как стандартный инокулюм. Затем все инокулированные семена были стерилизованы этанолом, вынуты и промыты стерилизованной водой.

Почва опытных делянок в поле была инфицирована стандартным инокулюмом в объёме 75 см3 на 1 м рядка делянки площадью 4 м² (2×2) с 4-кратной повторностью для инокулюма и 4-кратной без инокуляции. Учет поражения проводили в течение вегетации, а после уборки семена взвешивали для учета влияния поражения на урожай по сравнению с контрольным вариантом без инокуляции.

В тепличном варианте опыта растения также были инфицированы через почву. Семена каждого сорта гороха высевали в грунт со смесью торфа, песка, перлита и стандартного инокулюма (15 см3 на 5 семян). Через 4 недели проростки удалили из субстрата и тщательно промыли в воде. Симптомы болезни отмечали по шкале от 0 (здоровые растения) до 9 (семена не проросли), после чего растения высушивали и взвешивали. В итоге результаты полевой и лабораторной оценки коррелировали между собой.

Фузариозный фон люпина. По отношению к люпину применяют двух-трехлетнюю монокультуру сильно восприимчивого сорта, внесение в почву измельченных пораженных растений или размноженных на питательной среде патогенов (5, 6). В качестве питательного субстрата могут служить зёрна хлебных злаков, особенно, проса и овса. Под инфекционный фон используют участки, изолированные от хозяйственных посевов, чистые от сорняков и пригодные для возделывания зерновых бобовых культур.

Подготовленный инфекционный материал люпина в конце августа вносят на поле из расчета 150—200 г/м² под культивацию, которую проводят вслед за внесением инокулюма. В первый год после внесения инфекции участок следует засевать восприимчивым к фузариозному увяданию сортом люпина. Созданный таким способом инфекционный фон можно использовать в течение 6 лет. Более длительное его использование ведет к излишнему накоплению инфекции, повышению токсичности почвы и обеднению её питательными веществами, в силу чего растения сильно угнетаются и гибнут.

Весной проводится посев коллекционного и селекционного питомников в 3—4-кратной повторности с размещением стандарта через 10 делянок и сильно восприимчивых сортов-индикаторов.

В б. Новозыбковском филиале ВИУА (Россия) искусственный фузариозный фон для люпина создавали следующим способом. Почву инфицировали путем ежегодного внесения чистой культуры фузариоза (100 г/м²) и измельченной массы растений, пораженных корневой гнилью и трахеомикозным увяданием (5 кг/м²). В результате был создан достаточно жесткий инфекционный фон, на котором было идентифицировано 12 видов Fusarium. В Украинском институте земледелия фузариозный инфекционный фон для люпина в поле был создан путем внесения в почву высоковирулентных штаммов F.oxysporum var. arthoceras (App.et Wr.) Bilai, выделенных в зоне люпиносеяния.

Фузариозный фон сои. Подкина и Котляров разработали оригинальную методику создания фузариозного инфекционного фона для оценки селекционного материала сои, которая оказалась в 1,3—1,5 раза эффективнее общепринятых трудоёмких способов локального внесения инокулюма с семенами при посеве в рядки и лунки или диффузного внесения в почву инфекционного материала. На первом этапе выделили возбудителей болезни из растений сои, выращенных в основных зонах Краснодарского края (Россия). Патогенные изоляты всех видов Fusarium, размноженные на стерильных семенах подсолнечника, высушивали при комнатной температуре, измельчали на мельнице „Пируэт“ в течение 1 мин. и смешивали виды Fusarium в соотношении, установ-ленном в зависимости от частоты их встречаемости на посевах сои — 5 частей F. oxysporum : 3 — F. moniliforme: 2 — F. solani: 1 — F. gibbosum.

Полученный биопрепарат из расчета 10 г на 100 г семян, смоченных 15% гуммиарабиком или 5% ПВС (поливиниловый спирт), или 2% АКМЦ (натриевая соль карбоксилметилцеллюлозы). Эти вещества не оказывают токсического действия на семена, не угнетают развитие патогена, легко растворяются в воде, формируют на поверхности семени прочную плёнку, имеют высокую клеющую способность и хорошо удерживают инокулюм. После обработки семена просушивали (в таком виде они могут храниться в течение месяца) и затем высевали в поле.

При оценке сортов и линий сои на устойчивость к фузариозу в условиях Молдовы для размножения чистых культур и внесения в почву при посеве в поле использовали 20—30 наиболее эффективных изолятов, сочетающих способность к биосинтезу фузариевой кислоты и высокую активность гидролитических ферментов — протеаз и липаз. Ежегодная реизоляция позволяла судить о правильности отбора ти-пичных культур. Кроме того, дополнительно выделяли и вводили в фон изоляты, которые преодолевали устойчивость резистентных генотипов, для включения новых вариантов вирулентности, возникающих в популяциях. Это обеспечивало поражение восприимчивых сортов и линий сои на 80—100%, а устойчивых — на 10—20%.

Полевые методы оценки на устойчивость к аскохитозу и другим болезням. В INRA (Франция) разработан новый (простой метод (ПМ)) оценки устойчивости гороха к тёмнопятнистому аскохитозу (М. pinodes), применяемый в селекционных питомниках. Ранее (Tivoli, 1994) был разработан детальный метод, включающий оценку устойчивости каждого узла на стебле и прилистника по шкале 0—5 баллов. Этот детальный метод даёт точную оценку устойчивости генотипа гороха к тёмнопятнистому аскохитозу (ТПА), но требует много времени и разрушения растения и непригоден для селекционного питомника, где число генотипов очень велико, а устойчивый материал должен быть сохранён.

При применении ПМ были использованы два способа посева: микроделяночный (2×2 м) — обычный тип в селекционном питомнике и проволочный (wire), при котором элиминировалось взаимодействие между проявлением болезни и полеганием. Делянки инокулировали зерном ячменя, инфицированным смесью штаммов гриба. Оценивали, во-первых, визуально пропорцию пораженной части растения и, во-вторых, среднюю величину поражения каждого органа, включая стебель и прилистники по той же 5-балльной шкале. Оценку проводили в 3 срока в 1995—96 гг. и в один срок в 1997 на 10 растениях каждого генотипа. Измеряли также высоту поражения стеблей и прилистников.

Таким образом, оценка ПМ заражения стебля представляет оптимальную среднюю для всей пораженной части растения, а оценка заражения прилистников отражает степень поражения средней части растения, т.к. нижние прилистники трудны для оценки из-за старения в фазе цветения и налива семян. Knoppe & Hoppe в 1993—94 гг. изучали устойчивость разных генотипов гороха к двум болезням, вызываемым M. pinodes и Phoma medicaginis var. pinodella (syn. A. pinodella). Споры изолятов обоих патогенов использовали для инокуляции семян и побегов (изолят M. р. — Mp1 изолят Ph. m. — R15). Семена погружали в суспензию спор (106спор/мл), затем высушивали при 30°С в течение 4 часов и сразу высевали в поле. 10 недель спустя после посева растения опрыскивали такой же суспензией спор, дополненной 0,01% глюкозой и 0,01% экстрактом дрожжей для стимуляции прорастания спор.

Полевые опыты проводили в двух местах рендомизированными блоками в 3—4 повторностях. Поражение каждой болезнью оценивали на 25 растениях каждой делянки, ранжируя от 0 (нет поражения) до 9 (полная гибель). Поражение листьев, стеблей и бобов оценивали независимо, а на эпикотилях измеряли длину повреждений.

У нута эпифитотия аскохитоза была создана путем разброса инфицированных дробленых семян вирулентным в регионе патотипом внутри делянки. Ряды восприимчивой линии были высеяны после каждых 4 рядов и вдоль границы поля для увеличения распространения и выравненности инфекции. Устойчивость каждой линии нута оценивалась по 9-балльной шкале.

Инфекционный фон для заражения гороха вирусом обыкновенной мозаики гороха (PCMV), а люпина, кормовых бобов и яровой вики — вирусом желтой мозаики фасоли (BYMV) создавали путем их посева в изоляции от других посевов зерновых бобовых культур и инфицирования в фазе 2—3 листьев вирусами методом механической инокуляции. Культуру вирусов в чистом виде получали путем пассажей изолятов, отобранных в поле, на растения-дифференциаторы в условиях теплицы. Инокулюм готовили непосредственно перед заражением из листьев растений-накопителей, которые растирали в охлаждённом 0,1м фосфатном буфере при рН=7,0 (1:10) с добавлением активированного угля. Инокуляцию проводили вечером после захода солнца. Количество зараженных растений и интенсивность поражения по 5-балльной шкале отмечали через 14 и 21 день после инокуляции. В случае сомнительных результатов проводили индикаторный и серологический анализ.