Способы заражения растений:
Способы инфицирования в вегетационных и лабораторных условиях

автор:

Для оценки устойчивости к корневым гнилям в лабораторных условиях разработан экспресс-метод, основанный на проращивании семян гороха в суспензии F oxysporum f pisi в стерильных рулонах фильтровальной бумаги с последующей подрезкой корней. Метод позволяет в течение 10—15 дней определить реакцию сортообразцов и селекционного материала на поражение патогенном.

Романовой в ВИР разработан лабораторный метод ускоренной оценки растений гороха на устойчивость к афаномицетной корневой гнили. Работа выполнялась в следующей последовательности. Сначала нарезали листы фильтровальной бумаги длиной 100—120 см и шириной 20 см. В верхнем конце листа прочерчивали карандашом линию на расстоянии 3 см от верха. Линию размечали карандашом на отрезки по 10 см, бумагу слегка смачивали ватным тампоном, затем на 10 см-отрезки раскладывали 10 семян изучаемого образца. Всего на листе размещали 10—12 образцов по 10 семян каждого. После того, как семена разложены на листе их сверху накрывали вторым листом бумаги, одинаковым по размеру с нижним. Оба листа периодически смачивали ватным тампоном. Поверх фильтровальных листов семена накрывали лентой коррекса, после чего закручивали в рулон. Готовый рулон с семенами помещали либо в стеклянные сосуды, либо в кюветы.

На дно кюветы заливают воду для смачивания рулона из расчета, чтобы она покрывала 1,5—2 см нижнего конца рулона. Проростки появляются на 7—10 сутки, после чего производится инокуляция возбудителем афаномикоза или другого почвообитающего патогена. При этом чистая культура патогена в виде конидий, ооспор и т. д. вводится в воду. Конидии или ооспоры поднимаются вверх по фильтровальной бумаге вместе с водой и заражают корешки и проростки. Оценку степени поражения образцов гороха или другой зерновой бобовой культуры проводят спустя 7—10 дней после инокуляции. Рулоны можно периодически разворачивать для оценки поражения корневой системы. Рулоны желательно размещать на светоустановке или в теплице. Kraft et al. оценивали селекционные линии гороха по устойчивости к афаномикозу в полевых опытах и в чистой культуре в теплице одновременно в двух географических точках — США и Франции. Линии и коммерческие сорта высевали ежегодно в сильно инфицированном поле на однорядковых делянках длиной 3 м (100 семян) в двухкратной повторности или на 8-рядковых делянках длиной 9 м при 18 см-междурядьях в 6-кратной повторности.

В теплице 20 семян каждой линии выращивали на крупном перлите и спустя 5—7 дней после появления всходов инокулировали 50 мл суспензии зооспор (100000 зооспор/мл) при неинокулированном контроле каждой линии. При уборке учитывали массу надземной части и корней, число погибших растений, в т. ч. и в % к неинокулированному контролю.

Во Франции 7 генотипов гороха инокулировали зооспорами одного изолята Ае5 в теплице и через 18 дней растения были убраны. Учет провели по пораженности и массе всего растения.

Поражение 7-дневных корней устойчивых и восприимчивых генотипов гороха определяли при экспозиции 100 или 1000 зооспор в суспензии в течение 1 часа. Кроме того, была приготовлена поликлональная иммунная сыворотка для антигенов А. euteiches и использована для сравнительного определения размножения патогена в корнях устойчивых и восприимчивых линий (ELISA-учет). Для определения числа антигенов у линий гороха использовали 1см-секции из средней части каждого участка поражения.

Пораженность корней афаномикозом можно определить по степени образования ооспор. Для этого 5-дневные проростки инокулировали суспензией (70000 зооспор/мл) в течение 1 часа и инкубировали 4 дня при t=24°С. 1см-секции корней были вырезаны точно ниже семядолей, на которых и было подсчитано количество ооспор.

Для оценки устойчивости селекционного материала вики яровой к корневым гнилям был применен модифицированный метод проращивания семян в рулонах фильтровальной бумаги, ГОСТ 12038. Модификация заключалась в предварительном замачивании семян в течение суток в суспензии спор в культуральной жидкости возбудителей корневых гнилей из родов Fusarium, Aphanomyces, Rhizoctonia. Введение в состав инокулюма культуральной жидкости, содержащей токсины возбудителей, обеспечивает выявление защитных реакций растений различных генотипов.

Из каждого образца вики отбирали 115—120 семян с учетом степени твердосемянности. Затем семена промывали 2—3 раза вначале водопроводной, затем стерильной водой, помещали в чашки Петри и заливали подготовленной суспензией гомогената мицелия и культуральной жидкости из расчета 40 мл на чашку и оставляли на 1 сутки. В качестве контроля семена каждого образца вики замачивали в воде.

На второй день жидкость сливали, а семена раскладывали для проращивания на увлажненную стерильной водой полоску бумаги длиной 50 см и шириной 12—13 см по 50 семян на каждую полоску, накрывали листом фильтровальной бумаги такого же размера. Увлажнённые сверху полосы неплотно сворачивали в рулон, который по-мещали в химический стакан, на 1/3 заполненный дистиллированной водой. Каждую пробу семян раскладывали в 2 рулона и зтикировали. Стаканы с рулонами на 3 суток помещали в термостат при t=23—25°С для инкубирования патогена и проращивания семян. По истечении 3 суток стаканы с рулонами переносили из термостата на стеллажи под светоустановку 7—10 тыс. люксов и выращивали в течение 15 дней при t=22—25°С, подливая воду в стаканы по мере необходимости. Обычно к этому времени выявляются четкие иммунологические реакции растений на заражение патогенами.

Линии и сорта чечевицы оценивали на устойчивость к корневым гнилям и увяданию в теплице при инокуляции смесью Fusarium охysporum f. sp. lentis, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii в равной пропорции путем внесения в почву за 5 дней до посева инфицированных (15 г/кг) семян сорго. Через 10—20 дней учитывали процент семян, погибших до и после прорастания (52).

Оценка 92 образцов 8 диких видов рода Cicer на устойчивость к фузариозу проводилась в культуральной среде. Изоляты Fusarium были собраны в Центральной Италии и показали в предыдущих опытах высокую вирулентность. Инокулюм готовили путем встряхивания культуральной жидкости гриба на ротационной качалке в течение 10 дней по 8 часов в день при концентрации 106 спор/мл-1. Опыт проводили в теплице при t=22°С при естественном освещении, дополненном искусственным для получения 12-часового фотопериода. Семенную кожуру дважды прокалывали нагретой докрасна иглой для облегчения прорастания. Поверхность семян дизенфицировали гипохлоритом натрия в течение 5 мин., затем промывали в стерильной воде и выращивали на пластиковом подносе на влажном стерильном перлите. Спустя 10 дней проростки пересаживали в 200 мл пластиковые стаканы (4 проростка в каждый), содержащие 150 мл инокулюма. При необходимости добавляли воду в питательный раствор. Оценку поражаемости проводили через 30 дней после инокуляции по 5-балльной шкале.

В Колумбии разработан следующий способ оценки устойчивости фасоли к фузариозу. У однонедельных проростков восприимчивого и устойчивого в поле сортов отрезали кончики корней (1 см) и корни опускали на 5 мин. в суспензию спор высоковирулентного бразильского изолята возбудителя. Инокулированные проростки переносили в почву в теплицу, где поддерживалась температура 22—33°С и влажность 35—80%, и оценивали развитие болезни.

Наиболее оптимальной концентрацией спор в суспензии для оценки сортов по устойчивости оказалась 1×166 мл. Симптомы болезни на восприимчивых сортах фасоли появлялись на 5—9 день, а за 2—3 недели все растения восприимчивого сорта погибали. При оценке этим методом 66 линий фасоли результаты тесно коррелировали с данными полевой устойчивости.

Бледнопятнистый аскохитоз (A. pisi Lib.) гороха широко распространен на всех континентах земного шара, и расовый состав популяции паразита сильно варьирует в зависимости от климатических условий региона и географической отдалённости. Для изучения разнообразия вирулентности внутри A. pisi и устойчивости гороха были взяты 14 линий гороха, которые инъецировали 57 изолятами гриба, взятыми из различных ареалов Великобритании. Методика заражения и оценки заключалась в следующем.

Пораженные части листьев гороха сначала инкубировали в течение двух дней на водном агаре при t=25°С в темноте, затем переводили в режим 12-часового освещения при 20°С и 12-часовой темноты при 15°С. Изоляты получали при помещении отдельных пикнид в чашки Петри на среду, содержащую на 1 л 4 г мальтозы, 2 г KNO3, 1—2 г MgSO4, 2,68 г КН2РO4 и 20 г агара (среда Куна).

Инфицированные семена замачивали накануне в стерильной дистиллированной воде, затем поверхностно стерилизовали в гипохлорите натрия в течение 10 мин. После удаления семенной кожуры и зародышей семядоли отделяли, помещали в среду Куна и инкубировали в течение 10 дней, после чего пикниды использовали для приготовления культур. Культуры из верхушек гиф всех изолятов были получены из отдельных прорастающих спор, каждая из которых происходила из единичного ядра клетки.

Для получения конидий для инокуляции растений культуры выращивали на среде Куна при 15°С с 12-часовой сменой дня и ночи в течении 7 дней, затем в течении 7 дней при непрерывном освещении. Инокулюм готовили при разбавлении спорулированных культур стерильной водой и осторожном удалении спор стеклянной палочкой. Оптимальная концентрация составляла 2,5×105 спор/мл.

Опыты в теплице показали, что у некоторых генотипов гороха устойчивость листьев или листовых дисков, замоченных в растворе бензимидазола, отличается от устойчивости целого растения. Поэтому во всех испытаниях использовали для инокуляции целые растения. Семена высаживали с площадью питания 4,5×4,5 см на грунт, представляющий смесь одинаковых частей торфа и грубого песка на естественном дневном свете при температуре более 10°С. В фазе развёртывания второй пары настоящих листьев растения опрыскивали суспензией спор, затем помещали на 3 дня в культиватор, где влажность доводилась до полного насыщения.

В связи с тем, что степень развития симптомов болезни варьирует в зависимости от условий среды, во всех экспериментах в качестве контролей использовали 2 линии гороха: JI392, показавшую полную восприимчивость и линию JI423 с гиперчувствительной реакцией на расу „с„ из Нидерландов.

Для сравнительной оценки устойчивости сортообразцов кормовых бобов (V. fabo) в полевых и вегетационных опытах к Ascochyta fabae в теплице растения в фазе 5—7 листьев и в фазе цветения опрыскивали водной суспензией спор при 20—15°С (день — ночь). Параллельно инокулировали те же генотипы в поле. Степень поражения оценивали по 5-балльной шкале. Ранги генотипов по устойчивости были одинаковы в поле и теплице.

Ложная мучнистая poca (Peronospora viciae) является весьма вредоносной болезнью гороха и кормовых бобов в холодных и влажных условиях. Популяции P.v. очень изменчивы и у них идентифицировано много патотипов. Для оценки устойчивости гороха к этой болезни применяли следующую методику. 4 изолята Pv были собраны в 1994 г. и поддерживались на сорте Пелюшка. В каждом тесте 20 семян каждого из 11 сортов выращивали до первичных корешков длиной 2 см и затем погружали в суспензию (5 мл), содержащую 104 спор/мл каждого изолята перед пересадкой в торф с песком. После 14 дней роста растения покрывали полиэтиленовыми мешочками на 48 часов. Степень поражения оценивали по шкале 0—5, преобразованной в весовой индекс болезни (0—100), зависящий от числа растений в каждой инфекционной категории. Таким же способом инъецировали растения кормовых бобов.

В университете штата Иллинойс, США разработали способ оценки устойчивости сои к стеблевой гнили (Ph. gregata) с использованием семядолей в культуре ткани. Для работы использовали 3 расы гриба и 10 сортов сои, различающихся между собой по соотношению генов устойчивости. Кулыуральные фильтраты гриба после очистки добавляли к среде Мурасиге-Скуга, содержащей 1 мл 2,4Д, 1 мл кинетина, 5 мл БАП и на среду помещали семядоли. После 8 дней инкубации в темноте при 22,5°С и 8 последующих дней на свету при 24°С визуально оценивали степень позеленения семядолей по заранее разработанной схеме. Наименее устойчивые сорта при этом некротизировали. Результаты оценки, проведенной в трех различных модификациях, соответствовали оцекам по методу, принятому для тепличных условий.

В Австралийской селекционной программе по люпину принята стандартная процедура инокуляции в теплице возбудителем антракноза:

  • температура в теплице 18° С (16—20°С);
  • фаза развития — проростки инокулируются в фазе 6—8 листьев;
  • инокуляция — опрыскивание растений суспензией спор (конидий) -105 спор/мл; держать растения под пластиковым колпаком и инкубировать при 18°С в темноте в течение 18 часов;
  • учет поражения спустя две недели после инокуляции по 5-балльной шкале.

Оценка устойчивости сои к бактериальным болезням и определение видового состава последних была проведена по методике ВИР на Кубанской и Майкопской опытных станциях ВИР в России. Идентификацию видов бактерий, выделенных из пораженных семян, проводили путем искусственного заражения растений сои, а также кормовых бобов и эспарцета. Для инокуляции использовали листья и срезанные верхушки растений: патоген вводили в ткани листа или сосудистую систему растений 45-дневного возраста.

Отдельные листья раскладывали в чашки Петри нижней стороной вверх и на их поверхность очень тонким слоем раскладывали гигроскопическую вату, на которую наливали бактериальную суспензию двухсуточного роста в мясонапитанном бульоне. После этого накалывали листья препаравальной иглой. В контроле бактериальная суспензия заменялась остуженной кипяченой водой. Поражение болезнью учитывали через 6 дней. В результате изучения на Кубани было идентифицировано 9 видов возбудителей бактериальных заболеваний.

Для ускоренной оценки образцов сои к комплексу видов бактерий в качестве инокулюма служили штаммы бактерий, выделенные из пораженных семян сои. Образцы высевали в оптимальные сроки по 40 семян двухрядковыми делянками длиной 1 м. Растения выращивали до фазы 3—4 листьев и за 3 суток до заражения готовили инокулюм. Выделенные из семян или вегетативных частей растений и про-веренные на патогенность штаммы или популяции бактерий высевали для размножения в картофельный бульон на 2—3 суток и перед употреблением суспензию разводили остуженной кипяченой водой. Плотность бактериальной суспензии доводили до 1 млрд. клеток на 1 мл стерильной воды.

Молодые растения сои в фазе 3—4 настоящих листьев выдёргивали из почвы (по 10—12 растений на образец), помещали в ведро с водой и переносили в лабораторию. Растения с предварительно отрезанными корнями и верхней части стебля помещали в стаканчики ёмкостью 100—200 см3, заполненные суспензией-инокулюмом. Контролем служил чистый и аналогично разбавленный картофельный бульон.

Стаканчики с растениями оставляли на 1 сутки при температуре воздуха 18—20°С. Бактерии, получив свободный доступ в сосуды растений, вызывали их закупорку. Увядание растений вследствие трахе-обактериоза и токсичного действия патогена начиналось уже через несколько часов после закладки опыта. Оценку устойчивости образцов сои проводили по 5-балльной шкале.

Для определения устойчивости зерновых бобовых культур к вирусным болезням, в частности, к вирусу желтой мозаики фасоли (РУМУ) предложен способ непрямой оценки, который позволяет ускорить и упростить её процедуру. При этом выделяют изолированные протопласты и получают их суспензию с концентрацией хлорофилла 60—120 мкГ/мл. Суспензию инкубируют, перемешивая с очищенным вирусным препаратом с концентрацией вируса 50—200 мкГ/мл в течение 1—2 часов в темноте при t=2—4°С. Затем измеряют выделение хлоропластами кислорода на свету в присутствии феррицианида калия. Степень устойчивости к вирусу определяют по скорости выделения O2 — чем она выше, тем устойчивее образец.