Методы генетической инженерии в селекции зернобобовых культур на устойчивость к патогенам:
Трансгенная селекция гороха

автор:

Shade et al.(1994), Schroeder et al. (1995)впервые осуществили процедуру интродукции чужеродного гена, кодирующего устойчивость к насекомым-вредителям, в геном гороха. 4-генная конструкция рМСРЗ, основанная на агробактериальной плазмиде, включала: химерный ген, кодирующий ос-амилаза ингибитор (αАI), выделенный из фасоли (Ph. Vulgaris) и обладающий сильными инсектицидными свойствами; ген bar, используемый как селективный маркер в изучении характера наследования; репортерный ген GUS, обеспечивающий окрашивание в специфической среде трансгенных клеток в голубой цвет и селективный ген prtII, обеспечивающий устойчивость к канамицину.

В качестве реципиента был использован сорт гороха Greenfeast.

В этом эксперименте были изучены экспрессия, наследование и стабильность интродуцированных генов aAI-содержащей конструкции в 6 трансгенных (Т) поколениях. В результате было получено 18 независимых трансформированных фертильных растений гороха рМСРЗ. В каждом поколении отдельные семена испытывали на присутствие генов αA1, bar и GUS - активность и трансгенная природа их была подтверждена.

Потомства 5 трансгенных растений были использованы для скрининга экспрессии и характера наследования генов &alph;ai, bar и uidA, кодирующего GUS в Т0, Т1 и Т2 поколениях, а гена αai и в последующих ТЗ — Т6 поколениях. Растения Т10 («трансгеники») отличались высокой экспрессией белка αAI, составлявшего 3—3,5% от общего содержания растворимого белка семени, и сильной инсектицидной активностью.

Экспрессия всех трех генов (αai, bar, GUS) значительно отличалась от ожидаемой в поколении T1 3 : 1 (трансгеник : нормальный) в потомстве всех 5 трансгенных линий гороха. Несмотря на то, что все растения Т0 экспрессировали ген bar, у трех потомств из 5 bar не проявлял своего действия, но в Т2 экспрессия генов bar и GUS наблюдалась снова.

В результате проведенной работы были получены трансгенные линии гороха с новыми ранее не присущими этому виду признаками — устойчивостью к брухусу и толерантностью к гербициду BASTA. Последующие испытания показали полную устойчивость полученных трансгенных линий к трем видам жука — брухуса: зерновке вигновой и зерновке фасолевой Адзуки, которые сильно повреждают зерно при хранении и гороховой зерновке Bruchus pisorum — главному вредителю гороха на поле в Украине, Молдове и южных регионах России. К настоящему времени (1995) в Австралии ген αai, кодирующий устойчивость гороха к брухусу, путем обычного скрещивания с транс-гениками F10T5 интродуцирован в 5 коммерческих сортов. Проводится работа по созданию трансгеников гороха, устойчивых к вирусам и грибным болезням, особенно к аскохитозу.

Vivian излагает два молекулярных подхода к изучению базиса устойчивости гороха к различным болезням. Один из них заключается в приготовлении библиотек сДНК из ткани инфицированного хозяина и отборе клонов из тРНК транскриптов, которые специфически экспрессируют в инфицированной ткани.

Другой подход используется для решения проблем, связанных с общим большим размером растительных геномов, в т. ч. и гороха. Обычный садовый сорняк арабидопсис (Arabidopsis thaliana) имеет только 1/10 генома гороха. Следует подчеркнуть, что к настоящему времени геном арабидопсиса полностью расшифрован. Недавно открыто, что авирулентный ген, клонированный из расы 2 бактериального патогена Pseudomonas syringae pv. Pisi вызывает экотип-специфическую реакцию у A.thaliana, когда интродуцируется в Ps. syringae pv. maculicola (патоген, поражающий арабидопсис). Это открывает возможность нового пути клонирования R2 — гена устойчивости гороха.

Гипотеза Флора о состязании генов хозяина и патогена подтверждается изучением гена устойчивости гороха R2 и гена устойчивости арабидопсиса RPM1. Продукты устойчивости у обоих видов могут быть частично или полностью гомологичны. В таком случае имеется возможность идентифицировать 270kb область хромосомы III A.thaliana, в которой локазизован ген RPM1, и изолировать последний. Таким образом гомология генов устойчивости на уровне ДНК или пептида может быть использована для идентификации соответствующего гена гороха.

С использованием A.tumifaciens горох был трансформирован двумя векторами, содержащими гены белка оболочки вируса люцерновой мозаики (AMV). Трансгенные растения отбирали при использовании в качестве селективного агента канамицина. Потомство 4 трансгенных линий проявило устойчивость при механической инокуляции AMV.

Для повышения устойчивости гороха к темнопятнистому аскохитозу (M.pinodes) разрабатываются и альтернативные стратегии. Weimer сообщил об иммунитете к M.pinodes вида чины L.hirsutus, a Croft et al. установили, что устойчивость L. sativus по сверхчувствительной реакции даже у сильно восприимчивых образцов была значительно выше, чем у гороха. Это приводит к мысли об использовании генов чины для повышения устойчивости гороха в процессе трансгеноза.

Генетическая трансформация гороха открывает пути к интродукции в его геном различных кассет, несущих гены, кодирующие синтез антифитопатогенных веществ, которые могут придать определенную устойчивость к патогенам, в т. ч. и к тёмнопятнистому аскохитозу. Европейский проект Preleg (Pathogen Resistant Grain Legumes), начатый в 1997 г. преследует цель получения трансгенных болезнеустойчивых линий гороха . Эти альтернативные стратегии являются дополнением к внутривидовому подходу, заключающемуся в разложении частичной устойчивости на компоненты. Межвидовые источники генов от Lathyrus и других видов могут быть использованы в комбинации с внутривидовыми генами частичной устойчивости для гарантии высокого уровня желательной длительной устойчивости.

Другая Европейская программа (Contract AIR3-CT-94-1171) посвящена исследованию и использованию естественной и «инженерной» устойчивости гороха к вирусу мозаики семян гороха (PSbMV). Количество различных генов устойчивости sbm и их соответствующих патотипов вируса больше, чем 4 гена устойчивости и 3 патотипа, описанных ранее. NY-изолят патотипа Р4 может инфицировать образец гороха PI347422, описанный ранее, как устойчивый к Р4. Кроме этого, смесь трех индийских изолятов (PiM) вируса PSbMV преодолевает устойчивость линии гороха PI153586, несущей генный кластер sbml, sbm3 и sbm4, но не может инфицировать другие устойчивые линии.

При анализе гибридов гороха между устойчивой линией 835 и восприимчивой 744 было установлено, что гены sbml и sbm4 тесно сцеплены между собой и локализованы на хромосоме VI, так же, как ген er, контролирующий устойчивость к мучнистой росе. Было идентифицировано несколько молекулярных маркеров. Так, 10 AFLP и 2 RAPD, вероятно, сцеплены с кластером sbm и 4 AFLP и 4 RAPD сцеплены с геном er.

Была также идентифицирована генетическая детерминация патотипов P1 и Р4 — участок ДНК из 366 нуклеотидов кодирует 122 аминокислоты. Определены также различия между патотипами P1 и Р2. Для реализации процедуры трансформации гороха было сконструировано несколько векторов. Все конструкции были основаны на Е6-бинарном векторе, который включает nosbar poly А кассету для отбора трансформированных тканей при использовании гербицида BASTA.

Значительное число трансгенных растений было получено у сорта гороха Puget, как при использовании конструкции с использованием гена белка оболочки вируса патотипа Р1 (метод 1), так и Nib повторяющихся последовательностей (метод 2).

У трансгенных линий, полученных методом 1, устойчивости к болезни не наблюдалось. На трансгенных растениях, полученных методом 2, поражение вирусом проявилось спустя 10 дней после инокуляции. Однако, у трех линий часть растений были полностью свободны от инфекции верхних листьев на 30-й день после инокуляции. Вирусная инфекция проявлялась при инъецировании патотипом Р1. Вирусная инфекция наблюдалась с изолятами Р1, но не всегда с изолятами Р4.