Эффективность штаммов Bradyrhizobium japonicum на фоне местных популяций ризобий сои

Ключевые слова: B. japonicum 46, B. japonicum М8, биопрепарат, клубеньковые бактерии, конкурентоспособность, эффективный штамм, Ризобофит, соя.

Важную роль в формировании высоких урожаев сои играют специфические клубеньковые бактерии, вступающие в симбиоз с растением. Представлены результаты исследований по применению активных штаммов Bradyrhizobium japonicum для инокуляции сои на фоне местных популяций ризобий сои. Объектами исследования служили штаммы B. japonicum 46 и B. japonicum М8, антисыворотки 46, М8, 634б и КВ11, а также растения сои сорта Устя. Симбиотические свойства и конкурентоспособность штаммов клубеньковых бактерий сои изучали в вегетационных и полевом опытах на фоне различных популяций специфических ризобий. Нами изучены особенности взаимодействия активных штаммов B. japonicum 46 и B. japonicum М8 с соей на фоне местных популяций специфических ризобий. Показано, что абсолютное доминирование в клубеньках интродуцируемого штамма не всегда имеет принципиальное значение для увеличения урожайности. На фоне почвенных популяций клубеньковых бактерий наиболее эффективные симбиотические системы сои формируются не с одним, а с несколькими комплементарными, хотя и серологически отличными штаммами ризобий одного вида. Установлено, что наиболее активным симбиотическим азотфиксатором является штамм B. japonicum 46. Как биоагент препарата «Ризобофит» этот штамм способен выдерживать конкуренцию с представителями моно- и полиштаммовых популяций местных ризобий сои, обеспечивая стабильное увеличение надземной массы растений на 12,9-18,5% и повышение урожая зерна — на 17,0% относительно контроля. На штамм B. japonicum 46 получен патент Украины, который предложено использовать в производстве биопрепаратов для повышения урожайности сои.

Введение

На сегодняшний день самой распространенной зернобобовой культурой мирового земледелия является соя (Glycine max (L.) Merr.). Важную роль в формировании высоких урожаев этой культуры играют клубеньковые бактерии (ризобии), вступающие в симбиоз с растением и обеспечивающие его биологическим азотом [1]. В современных технологиях выращивания сои широко используются биопрепараты на основе высокоэффективных штаммов специфических ризобий. Одним из таких биопрепаратов, предназначенных для повышения урожайности сои, является разработанный в Украине препарат «Ризобофит» (ТУ У 319.00494456-006:2002).

Известно, что обработка семян бобовых культур микробными препаратами способствует формированию в почвах местных популяций клубеньковых бактерий. Однако представители этих популяций, утратив способность к азотфиксации, могут выступать одним из лимитирующих факторов эффективного применения биопрепаратов [2, 3]. Встречающиеся в литературе данные по изучению эффективности инокуляции бобовых растений на фоне почвенных популяций ризобий достаточно противоречивы.

Учитывая вышесказанное, цель наших исследований — изучить особенности взаимодействия активных штаммов Bradyrhizobium japonicum с соей на фоне местных популяций специфических ризобий.

Объекты и методы исследований

Объекты исследования: штаммы B. japonicum 46, B. japonicum М8; антисыворотки к штаммам B. japonicum 46, М8, 634б и КВ11, а также растения сои сорта Устя. Исследуемые штаммы хранятся в Коллекции полезных почвенных микроорганизмов Института сельскохозяйственной микробиологии и агропромышленного производства НААН (ИСМАП НААН, Украина, г. Чернигов).

Симбиотические свойства штаммов клубеньковых бактерий сои изучали в вегетационных и полевом опытах на фоне моно- и полиштаммовых популяций специфических ризобий. Вегетационные опыты проводили на дерново-подзолистой супесчаной почве. Семена обрабатывали ризобофитом (жидкая форма) на основе штаммов B. japonicum 46 и B. japonicum М8 из расчета 200-300 бактериальных клеток на 1 семя. Повторность опытов 5-8-кратная. Полевой опыт проводили на темно-серой почве опытного участка ИСМАП НААН. Повторность опыта 4-кратная. Площадь учетной делянки — 6 м². Размещение делянок рендомизированное.

Конкурентоспособность штаммов (отношение количества образованных штаммом клубеньков к общему количеству клубеньков, выраженное в процентах) определяли в реакции агглютинации методом Груббера-Видаля [4]. В качестве антигена использовали гомогенаты клубеньков (50 шт. из каждого варианта). Поликлональные О-антисыворотки к штаммам ризобий сои получали по методике ВНИИСХМ в нашей модификации [5].

Активность азотфиксации определяли ацетиленовым методом на газовом хроматографе Chrom-4. Математическую обработку данных осуществляли по методике Б.О. Доспехова [6], а также использовали программу Statistica 7.0.

Результаты и их обсуждение

В вегетационном опыте изучали эффективность биопрепарата «Ризобофит» на основе активных штаммов B. japonicum 46 и B. japonicum М8. Опыт проводили на дерново-подзолистой почве, отобранной через год после выращивания сои, инокулированной стандартным штаммом B. japonicum 634б.

Анализ полученных данных свидетельствует, что на корнях контрольных растений (без инокуляции) сформировалось значительное количество клубеньков (32 шт/раст.) (табл. 1). Серологический анализ гомогенатов этих клубеньков показал, что все они образованы одним, ранее интродуцированным в почву, штаммом B. japonicum 634б (рис. 1).

Обработка семян сои Ризобофитом способствовала увеличению количества клубеньков в 1,2-1,5 раза. Максимальным этот показатель был в варианте с инокуляцией штаммом B. japonicum 46 (48 шт/раст.). Серологическая идентификация клубеньков показала, что на фоне моноштаммовой почвенной популяции ризобий сои наиболее конкурентоспособным оказался штамм B. japonicum 46. Он обнаружен в 79,2% клубеньков, тогда как штамм B. japonicum М8 выявлен в 62,5% клубеньков (рис. 1). Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что при инокуляции сои активными штаммами наблюдаются существенные изменения в «клубеньковой» популяции ризобий. В результате этих изменений снижается количество клубеньков, образованных местными ризобиями, а интродуцированные штаммы занимают доминирующее положение, что служит критерием их высокой конкурентоспособности.

В вариантах с инокуляцией также отмечено существенное увеличение массы клубеньков (в 1,2-1,3 раза) и их нитрогеназной активности (в 1,2-2,0 раза) относительно контроля. Сравнительный анализ всех симбиотических показателей показал, что наиболее активным симбионтом сои на фоне моноштаммовой популяции местных ризобий оказался штамм B. japonicum 46. В этом варианте отмечено достоверное увеличение продуктивности растений на 18,5% в сравнении с контролем и на 3,7% в сравнении со штаммом B. japonicum М8.

Рис. 1. Конкурентоспособность штаммов клубеньковых бактерий сои — биоагентов препарата «Ризобофит» (вегетационный опыт)

Следующим этапом наших исследований было оценить эффективность штаммов B. japonicum 46 и B. japonicum М8 на фоне многочисленной популяции микросимбионтов сои, присутствующей в почве. Эта популяция была сформирована при периодическом (в течение 10 лет) выращивании сои, инокулированной различными штаммами.

Анализ в реакции агглютинации гомогенатов клубеньков контрольного варианта показал, что местная популяция ризобий сои представлена бактериями, относящимися к серогруппам 46, М8 и КВ11 в соотношении 14,6; 2,1 и 68,7% соответственно (рис. 2). Кроме того, в почве выявлены ризобии, не реагирующие с использованными антисыворотками, которые отнесены к серогруппе Х (14,6%).

На фоне такой полиштаммовой популяции клубеньковых бактерий инокуляция сои Ризобофитом способствовала увеличению количества клубеньков на 26,3-27,6% в сравнении с контролем (табл. 2). Причем штаммы-инокулянты существенно влияли на процесс инфицирования растений местными ризобиями (рис. 2). Так, при обработке сои штаммами B. japonicum 46 и B. japonicum М8 число клубеньков, образованных доминирующими в почве бактериями серогруппы КВ11, уменьшалось с 68,7% в контроле до 42,2-56,3% в вариантах с инокуляцией. Следует отметить, что штамм B. japonicum 46 оказался более конкурентоспособным и при наличии в почве многочисленной популяции местных ризобий, формируя значительное количество клубеньков (42,2%). Штамм B. japonicum М8 обнаружен только в 22,9% клубеньков.

Кроме того, использование штамма B. japonicum 46 способствовало достоверному увеличению массы клубеньков (с 0,30 в контроле до 0,36 г/раст. в варианте с инокуляцией).

Проведенные исследования показали, что в вариантах с инокуляцией сои ризобофитом уровень азотфиксирующей активности был выше в 1,2-1,4 раза, чем в контроле (табл. 2). Лучшим азотфиксатором оказался штамм B. japonicum 46. Количество фиксированного азота при инокуляции этим штаммом составило 42,38 мкг N/раст/ч.

Как результат эффективного взаимодействия исследуемых штаммов с растением в вариантах с инокуляцией отмечено увеличение надземной массы сои на 8,6-12,9% по сравнению с контролем (табл. 2). Максимальным этот показатель (1,58 г/раст.) был при инокуляции сои штаммом B. japonicum 46, более низким (1,52 г/раст.) — при использовании штамма B. japonicum М8.

Рис. 2. Конкурентоспособность штаммов клубеньковых бактерий сои — биоагентов препарата «Ризобофит» (вегетационный опыт)

Анализ результатов серологического исследования клубеньков и данных по продуктивности растений позволяет предположить, что абсолютное доминирование в клубеньках интродуцируемого штамма не всегда имеет принципиальное значение для увеличения урожайности. Возможно, что штамм-инокулянт не только сам активно инфицирует растение, но и является своеобразным активатором местной популяции клубеньковых бактерий, что способствует формированию эффективной симбиотической системы сои с несколькими комплементарными, хотя и серологически отличными штаммами ризобий одного вида.

Следующим этапом нашей работы было изучить конкурентоспособность и симбиотические свойства штаммов B. japonicum 46 и B. japonicum М8 в полевых условиях.

В течение вегетационного периода на корнях контрольных растений количество клубеньков не превышало 2-3 шт/раст., что свидетельствует о наличии в почве немногочисленной популяции ризобий сои (табл. 3). Серологический анализ гомогенатов клубеньков показал, что они образованы клубеньковыми бактериями сои, относящимися к одной серогруппе М8 (рис. 3).

На фоне моноштаммовой почвенной популяции штаммы B. japonicum 46 и B. japonicum М8 способствовали значительному увеличению количества клубеньков в сравнении с вариантом без инокуляции (табл. 3). Оба штамма формировали одинаковое количество клубеньков с одинаковой массой.

Установлено, что интродукция штамма B. japonicum 46 заметно влияет на процесс формирования клубеньков местными ризобиями (табл. 3). В этом варианте отмечено существенное уменьшение (до 14,6 %) количества клубеньков, образованных штаммом B. japonicum М8, сапрофитно существующим в почве. То есть при наличии в почве немногочисленной популяции ризобий сои интродуцированный штамм доминировал в клубеньках (85,4%), что подтверждает его способность конкурировать с местными клубеньковыми бактериями.

Показано, что во всех вариантах с инокуляцией активность азотфиксации была значительно выше (в 1,7-2,5 раза) в сравнении с контролем. Максимальный уровень азотфиксирующей активности наблюдался в варианте с применением ризобофита на основе штамма B. japonicum 46 (10,65 мкг N/раст/ч).

Рис. 3. Конкурентоспособность штаммов клубеньковых бактерий сои — биоагентов препарата «Ризобофит» (полевой опыт, 2013 г.)

При инокуляции семян сои активными штаммами клубеньковых бактерий урожайность культуры увеличивалась на 13,4-17,0% (табл. 4). Следует отметить, что, несмотря на наличие в почве местных клубеньковых бактерий серогруппы М8, интродукция активного штамма этой же серогруппы (B. japonicum М8) способствовала формированию более активной симбиотической системы и существенному увеличению урожайности сои. Максимальный прирост урожая к контролю (17,0%) получен при использовании высокоэффективного штамма B. japonicum 46. На этот штамм получен патент Украины на изобретение [7].

Выводы

Таким образом, нами изучены симбиотические свойства штаммов B. japonicum 46 и B. japonicum М8 как биоагентов препарата «Ризобофит». Показано, что абсолютное доминирование в клубеньках интродуцируемого штамма не всегда имеет принципиальное значение для увеличения урожайности. На фоне почвенных популяций клубеньковых бактерий наиболее эффективные симбиотические системы сои формируются не с одним, а с несколькими комплементарными, хотя и серологически отличными штаммами ризобий одного вида.

Установлено, что наиболее активным симбиотическим азотфиксатором является штамм B. japonicum 46. Он способен выдерживать конкуренцию с представителями моно- и полиштаммовых популяций местных ризобий сои, обеспечивая стабильное увеличение надземной массы растений на 12,9-18,5% и повышение урожая зерна — на 17,0% относительно контроля. На штамм B. japonicum 46 получен патент Украины, который предложено использовать в производстве биопрепаратов для повышения урожайности сои.

Библиографический список
• Бабич А.О. Сучасне виробництво і використання сої. — Київ: Урожай, 1993. — 432 с. 2. Толкачев Н.З. Потенциальные возможности симбиотической азотфиксации при выращивании сои на юге Украины // Мікробіол. журн. — 1997. — Т. 59. — № 4. — С. 34—41.
• Патика В.П., Крутило Д.В., Ковалевська Т.М. Вплив аборигенних популяцій бульбочкових бактерій сої на симбіотичну активність інтродукованого штаму Bradyrhizobium japonicum 634б // Мікробіол. журн. — 2004. — Т. 66. — № 3. — С. 14—21.
• Кэбот Э., Мейер Б. Экспериментальная иммунология. — М.: Медицина, 1968. — 677 с.
• Берестецкий О.А. Методические рекомендации по получению новых штаммов клубеньковых бактерий и оценке их эффективности. — Л., 1979. — 33 с.
• Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. — М.: Агропромиздат, 1985. — 352 с.
• Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum для одержання бактеріального добрива під сою: пат. 85943 України: МПК С 12 N 1/20, С 05 F 11/08 / Ковалевська Т.М., Надкернична О.В., Крутило Д.В., Горбань В.П.; заявник та патентовласник Ін-т с.-г. мікробіології УААН. — № а 2007 07156; заявл. 25.06.07; опубл. 10.03.09, Бюл. № 5. — 4 с.