CRISPR-Cas як передовий метод селекції рослин

Вступ

Протягом більш як 90-річної історії Pioneer був лідером просування підвищеної продуктивності в сільському господарстві через покращення культур. Компанія, заснована в 1926-му як Hi-Bred Corn Company, очолила революцію в селекції кукурудзи, яка за допомогою гібридизації дозволила істотно збільшити урожаї. З впровадженням в сільському господарстві в 1990-і методів біотехнології компанія показала, що бажані ознаки зі сторонніх джерел можуть бути привнесені в сорт чи гібрид. Наприклад, інтродукція ознаки Bt з грунтової бактерії дає кукурудзі можливіть самій захищатися від шкідників, таким чином покращуючи урожай кількісно і якісно.

Зараз прориви в галузі редагування геному підводять нас до третьої революції в покращенні рослин, яке буде використовуватися як доповнення до існуючих технологій. Редагування геному – це процес внесення точних цільових змін в нитку ДНК, зроблену з послідовностей з чотирьох базових нуклеотидів (цитозину, гуаніну, аденіну і тиміну), які входять до складу генів та інших геномних ознак і визначають характеристики і різноманітність рослин. В той час, як поточне застосування CRISPR-Cas все ще є складним, за своєю концепцією воно подібне до редагування документа за допомогою текстового процесора. В цій аналогії інструмент CRISPR-Cas є курсором, який можна встановити в потрібному місці речення. Позиціонування цього курсора робить можливим видаляти, міняти або вставляти літери або навіть слова в вибране місце і покращувати, таким чином, текст. В такий самий спосіб за допомогою CRISPR-Cas можна виділяти наявні в рослині генетичні послідовності і вности зміни, забезпечуючи бажані характеристики. Очікується, що ця революційна технологія допоможе вченим у створенні іновативних і екологічно раціональних рішень для фермерів, подібних до тих, які досягаються традиційними методами селекції, але ще кращої якості, точності та часової ефективності.

В справі редагування геному CRISPR-Cas є одним із найбільш захопливих методів, який був дуже швидко пристосований завдяки таким перевагам над іншими методами як: якість, ефективність та технічна гнучкість. CRISPR-Cas має величезний потенціал застосування, який виходить далеко за межі сільського господарства, і в останні кілька років привернув до себе значну кількість уваги світових ЗМІ після того, як кількість дослідженнь в цьому напрямку буквально вибухнула (Рис. 1). Pioneer є лідером по CRISPR-Cas в сільському господарстві і оголосив наміри запропонувати на ринку перший комерційний продукт створений з використанням CRISPR-Cas вже за 5 років, після польових досліджень та відповідних регуляторних оглядів. Мета цієї статті полягає в короткому огляді історії CRISPR-Cas, його використання як знаряддя редагування геному та того, як Pioneer використовує цю технологію для пришвидшення приходу нової ери покращення рослин.

Історія CRISPR-Cas

Вперше дослідження, яке пізніше стане відомим як CRISPR-Cas, було оприлюднене в 1987 році дослідниками з Японії, які вивчали ділянки геному E. coli. Вони ідентифікували присутність п’яти ідентичних послідовностей ДНК-повторів, відділених неповторюваними послідовностями ДНК одного й того самого розміру. В той момент на це звернули увагу як на курйоз, але залишили без пояснень (Ishino et al., 1987). Що більше геномів секвенували, то більше знаходили таких повторюваних ознак у бактерій, включаючи бактерії, які приймають участь у виробництві йогурту та сиру, та бактерій, які живуть в кишках людини. Загадковості додавало те, що ці повторення регулярних інтервалів супроводжувалися тими самими групами генів. Повторювані ділянки було врешті-решт названо «CRISPR», скороченням від «короткі паліндромні повтори, регулярно розташовані групами», а супутні гени отримали назву «Cas», скорочено від «асоційовані з CRISPR» або «CRISPR-associated genes» (Jansen et al., 2002). Нарешті було усвідомлено, що послідовності між повторами мають риси, спільні з вірусами, які інфікують ці бактерії подібно до записів про імунізацію, та що деякі з генів, асоційованих з Cas, кодують білкові області, пов’язані з розрізанням ДНК.

На той час вже було добре відомо, що для розрізання ДНК бактеріофагів (вірусів, які інфікують бактерії) бактерії використовують білки. Тож відразу з’явилася гіпотеза, що CRISPR був свого роду послідовністю, асимільованою з геному вірусів-окупантів в спейсерні послідовності і протеїни Cas для вирізання ДНК інфікуючих вірусів. Команда дослідників компанії Danisco (придбаною DuPont в 2011 році) на чолі з Філіпом Хорватом (Phillippe Horvath) надала перший біологічний факт, що CRISPR-Cas складає в бактерії імунну противірусну систему. Дослідження, проведене його командою, показало, що штами бактерій йогурту Streptococcus thermophilus, які пережили вірусну інфекцію, мали вбудовані в своїх CRISPR-локусах послідовності з геному вірусів, які їх вражали. Після цього ці штами бактерій Streptococcus thermophilus ставали стійкими до наступних інфікувань цим вірусом (Barrangou et al., 2007). Цей прорив грунтувався на попередній першовідкривацькій роботі Хорвата та колег в ранні 2000-ні, які початково застосовували CRISPR для бактеріальної ідентифікації, потім - як можливіть покращити стійкість початкової культури штамів проти атаки бактеріофагів.

З роками було ідентифіковано численні системи CRISPR-Cas з індивідуальними характеристиками. З цього ряду виділяється одна з серій відкриттів періоду між 2011 та 2012 роками, яка і висунула системи CRISPR-Cas на передній фронт революції в редагуванні геному. Згідно з цим відкриттям три складники цієї системи характеризуються як необхідні і достатні, щоб специфічно зчитати і розрізати ДНК, молекулу, яка утворює геном і кодує інструкції життя (Рис. 2.).

Першим складником є білок, який називають Cas9 – білок, закодований геном Cas9. Додатково до механізму розрізання молекули ДНК він також розпізнає дуже короткий відрізок поблизу послідовності ДНК, яка відповідає за ініціацію процесу зчитування ДНК. Другим складником є РНК (споріднена з ДНК), яка походить з локуса CRISPR, що містить послідовність, яка встановлює послідовність ДНК, яку потрібно розрізати. Ця РНК відома як CRISPR РНК (crРНК) і відповідає за зв’язування цільової ДНК. Третім складником є друга РНК (відома як tracrРНК), яка також походить з локуса CRISPR і служить зв’язкою для асоціювання послідовності crРНК з білком Cas9 (Deltcheva et al., 2011).

В 2012 році кілька наукових журналів опублікували звіти про те, що цих трьох складників достатньо для зчитування і розрізання ДНК, і що crРНК можна змінити так, щоб вона розпізнавала практично будь-яку послідовність ДНК з будь-якого організму. Щоб спростити систему і покращити її ефективність, було визначено, що crРНК і tracrРНК можуть бути скомбіновані в просту РНК (Рис. 2). Ця легко програмована двохкомпонентна система Cas9 керована РНК є на сьогодні інструментом CRISPR-Cas, який найбільш широко використовується всіма галузями біологічних наук (Jinek et al., 2012; Mali et al., 2013).

CRISPR-Cas полегшує вдосконалення рослин

Білок CRISPR-Cas, Cas9, полегшує редагування геному, функціонуючи як точні і програмовані молекулярні ножиці, які розрізають ДНК в визначеному місці. Після розрізування цільової послідовності ДНК система CRISPR-Cas за допомогою природних клітинних механізмів відновлення ДНК видаляє, редагує або вставляє гени.

Багатоклітинні організми, включаючи рослини, постійно стикаються з розривами ДНК, викликаними зовнішніми чинниками, такими як сонячне світло, а також внутрішніми процесами, такими як вивільнення вільних молекулярних радикалів. Щоб вижити, ці організми виробили ефективні механізми відовлення численних ДНК-розривів, які стаються в кожній клітині кожного дня. Відновлення ДНК можна класифікувати двома шляхами: 1) негомологічні з’єднання кінців та 2) гомологічні рекомбінації (Рис. 3).

Негомологічні з’єднання кінців (скорочено NHEJ) є домінуючим способом відновлення ДНК у рослин. Вони не використовують шаблон ДНК для процесу відновлення і просто ідентифікують два розірваних кінці ДНК та вставляють їх назад. Цей процес відновлення ДНК може часто приводити до вставлення або видалення випадкових послідовностей ДНК в місці відновлення. Якщо розірвана ДНК-послідовність представляє ген рослини, функція цього гена порушується і видаляється.

Гомологічні рекомбінації (часто їх позначають як HDR) потребують другу нерозірвану нитку ДНК, яка містить послідовність ідентичну до розірваної частини, а також бажану зміну (редагування, специфічна і цільова заміна послідовності або додатковий генетичний матеріал для вставлення). Вони використовують нерозірвану ДНК-нитку як шаблон для відновлення ДНК.

Видалення генів

За допомогою Cas9 можна видаляти потрібні гени, вирізаючи їх з геному. Відновлення способом NHEJ можна використовувати або для того, щоб розірвати послідовність ДНК, яка кодує гени, або у випадку двох розрізів по бокам гена, щоб повністю видалити ген. Прикладом застосування такого способу є наступне покоління восковидних гібридів Pioneer.

Керована селекція

CRISPR-Cas робить можливим пряму передачу ознак між членами одного виду, наприклад різними інбредами кукурудзи. Гомологічної рекомбінації можна досягнути в цільовому інбреді кукурудзи, використовуючи шаблон відновлення, що походить з послідовності ДНК, яка нас цікавить в іншому інбреді. Це – пряма цільова передача потрібної ознаки кукурудзи (наприклад, стійкість до стресу), і завдяки CRISPR-Cas, на відміну від традиційної селекції, передається тільки ця ознака з більшою ефективністю та без «доважок» у вигляді додаткового генетичного матеріалу від інбреда-джерела. Завдяки досвіду Pioneer у передаванні ознак напряму в елітні інбреди, селекційна точність, асоційована з цим процесом, дає змогу інтродукувати ознаки напряму в найновіші елітні інбреди з меншим негативним впливом (наприклад, зниженням урожаю) від процесу інтрогресії (Рис. 4).

Трансгенні ознаки

HDR, полегшений через CRISPR-Cas, можна також використовувати для інтродукції ознак зі сторонніх (не-рідних) джерел (наприклад, трансгени). Здатність CRISPR-Cas зробити це цільовим способом забезпечує значну перевагу над трансгенними методами вставок, які сьогодні використовуються на ринку для створення трансгенних продуктів. CRISPR-Cas можна також використовувати для поєднання кількох трансгенів разом та виокремлення їх в окремий селекційний локус, що, в свою чергу, істотно спрощує процес інтрогресії ознаки.

Сільськогосподарське застосування CRISPR-Cas

Передова селекція

Pioneer створює передову платформу селекції на основі CRISPR-Cas для створення насіннєвих продуктів з потужнішою природньою життєздатністю, продуктивністю та екологічністю. CRISPR-Cas має численні потенційні сільськогосподарські застосування, такі як покращення урожайності, стійкість до хвороб та посухи, а також покращення, вигідні для кінцевих споживачів – зовнішній вигляд, поживний вміст тощо.

В нещодавно опублікованих наукових матеріалах вчені Pioneer описують перше застосування CRISPR-Cas для покращення вже присутньої в кукурудзі здатності рослин переживати стрес посухи (Shi et al., 2016). CRISPR-Cas використовувася для визначення гена, ідентифікованого по його природній здатності сприяти посухостійкості. Польові випробування гібридів кукурудзи, які було отримано в результаті, показали в середньому 3,2 ц/га вищий урожай зерна в умовах недостатнього зволоження. Нещодавно було проведено додаткові випробування для визначення комерційного потенціалу в різних умовах середовища. Інші публікації Pioneer, пов’язані з передовою селекцією рослин на основі CRISPR-Cas, включають звіти, які висвітлюють ефективність і гнучкість систем CRISPR-Cas як в кукурудзі (Svitashev et al., 2015; Svitashev et al., 2016), так і в сої (Li et al., 2015).

Покращені гібриди восковидної кукурудзи

Весною 2016 року Pioneer анонсував свій перший комерційний сільськогосподарський продукт, створений за допомогою передової технології селекції CRISPR-Cas – наступне покоління восковидних гібридів (реліз новин Pioneer, 2016). Очікується, що ці гібриди будуть доступними для американських фермерів через п’ять років, після польових випробувань і відповідних регуляторних оглядів.

Вперше описані в ранні 1900-і, восковидні зерна кукурудзи містять >97% амілопектинового крохмалю замість звичних ~75% в традиційній жовтозерній кукурудзі і використовуються для різного роду щоденного харчового і нехарчового споживання (Рис. 5). В Сполучених Штатах вирощується біля 200 тисяч га восковидної кукурудзи. Pioneer є провідним світовим постачальником восковидних гібридів кукурудзи.

Через труднощі та обмеження, пов’язані зі створенням восковидних гібридів методами традиційної селекції, восковидна кукурудза є ідеальним продуктом для імплементації передової селекції рослин на основі CRISPR-Cas. Сьогоднішні восковидні продукти кукурудзи містять частково видалені гени, які відповідають за синтез амілози в ендоспермі. Видалення восковидних генів приводить до порушеннь в синтезі амілози, і тому майже весь крохмаль такої зернівки складається з амілопектину. Pioneer вже довгий час займається введенням цієї форми гена в нові елітні інбреди кукурудзи. Проте, цей процес займає багато років і супроводжується «доважкою» у вигляді неелітної генетики. Результатом є те, що восковидні гібриди мають в порівнянні з елітними гібридами меншу врожайність. Використовуючи передову селекцію рослин на основі CRISPR-Cas, восковидний ген можна видалити повністю в найсучасніших елітних інбредах. Таке пряме коригування восковидних характеристик зменшує час, необхідний для створення восковидних гібридів, та дозволяє уникнути зменшення урожайності, пов’язане з інтрогресією ознаки через традиційну селекцію.

Співробітництво з CIMMYT

Восени 2016 року Pioneer та Міжнародний Центр покращення кукурудзи та пшениці (CIMMYT) уклали угоду про спільне створення покращених ліній з використанням редагування геному за допомогою CRISPR-Cas для задоволення потреб дрібних фермерських господарств у всьому світі. Перший проект дозволить застосувати інструмент CRISPR-Cas для вирішення проблеми летального некрозу кукурудзи (MLN) в Суб-Сахарській (Тропічній) Африці. Вперше зафіксована в Кенії в 2011 році, хвороба поширилася на сусідні країни менш як за п’ять років і зменшила виробництво кукурудзи в середньому на 3% в сухих зонах і на 32% в більш вологих середовищах з втратою до 90% зерна на деяких фермах. В Кенії летальний некроз кукурудзи завдав шкоди близько чверті загального виробництва кукурудзи, з річними втратами близько 52 мільйони доларів США (Mahuku et al., 2015). Pioneer радий можливості співробітництва з іншими для реалізації повного потенціалу технології передової селекції на базі CRISPR-Cas.

Висновки

Багато бактерій захищають себе від вірусів, які вбудовуються в їх клітини, за допомогою адаптивної імунних механізмів, відомих як CRISPR-Cas. Ці CRISPR-Cas механізми можуть розпізнавати генетичні послідовності специфічні для цих загарбників і видаляти їх.

CRISPR-Cas можна перепрофілювати у молекулярні ножиці, які будуть робити розрізи в певних місцях рослинного генома. Після такого розрізу власний внутрішній відновлювальний механізм клітини може внести точні зміни в місце визначене для розрізу.

CRISPR-Cas як передове знаряддя селекції рослин є дуже багатообіцяючим і потужним. Воно може полегшити точну селекцію через розвиток природніх характеристик, які вже є в культурі через процес, який зараз часто називають «редагування геному».

CRISPR-Cas можна використовувати для створення трансгенних культур.

DuPont Pioneer є світовим лідером в застосуванні CRISPR-Cas для передової селекції в рослинництві і зараз створює свій перший продукт на основі CRISPR-Cas – нове покоління восковидної кукурудзи, яке буде продуктом-піонером в сільському господарстві розробленим за допомогою цієї новітньої технології.

Pioneer радий можливості співпрацювати з іншими для реалізації повного потенціалу передової технології селекції CRISPR-Cas. Як приклад, було засновано публічно-приватне партнерство з Міжнародним центром покращення кукурудзи та пшениці (CIMMYT) для впровадження технології CRISPR-Cas у задоволення потреб дрібних фермерів всього світу.

References
• Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A., Horvath, P. 2007. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 315:1709-1712.
• Deltcheva, E., Chylinski, K., Sharma, C.M., Gonzales, K., Chao, Y., Pirzada, Z.A., Eckert, M.R., Vogel, J., Charpentier, E. 2011 CRISPR RNA maturation by transencoded small RNA and host facter RNase III. Nature 471:602-607.
• Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., Nakata, 1987 A. Nucleotide sequence of the iap gene for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escheria coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology 169:5429-5433.
• Jansen, R., van Embden, J.D.A., Gaastra, W., Schouls, L.M. 2002 Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology 43:15651575.
• Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., Charpentier, E. 2012 A programmable dual-RNAguided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337:816-821.
• Li, Z., Liu, Z.B., Xing, A., Moon, B.P., Koellhoffer, J.P. Huang. L., Ward, R.T., Clifton, E., Falco, S.C., Cigan, A.M. 2015 Cas9-guide RNA directed genome editing in soybean. Plant Physiology 169:960-970.
• Mali, P., Yang, L., Esvelt, K.M., Aach, J., Guell, M., DiCarlo J.E., Chruch, G.M. 2013 RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339:823-826.
• Mahuku, G., Lockhart, B.E., Wanjala, B., Jones, M.W., Kimunye, J.N., Stewart, L.R. Cassone, B.J., Sevgan, S., Nyasani, J.O., Kusia, E., Kumar, P.L., Niblett, C.L., Kiggundu, A., Asea, G., Pappu, H.R., Wangai, A., Prasanna, B.M., Redinbaugh, M.G. 2015 Maize lethal necrosis (MLN), an emerging threat to maize-based food security in sub-Saharan Africa. Phytopathology 105:956965.
• Pioneer news release. 2016 https://www.pioneer.com/home/site/about/news-media/news-releases/template.CONTENT/guid.1DB8FB71-1117-9A56-E0B6-3EA6F85AAE92
• Sander, J., Joung, J.K. 2014 CRISPR-Cas systems for editing, regulating, and targeting genomes. Nature Biotechnology 32:347-355.
• Shi, J., Gao, H., Wang, H., Lafitte, H.R., Archibald, R.L., Yang, M., Hakimi, S.M., Mo, H., Habben, J.E. Plant Biotechnology Journal Epub ahead of print.
• Svitashev, S., Young, J.K., Schwartz, C., Gao, H., Falco, S.C., Cigan, A.M. 2015 Targeted mutagenesis, precise gene editing, and site-specific gene insertion in maize using Cas9 and guide RNA. Plant Physiology 169:931-45.
• Svitashev, S., C. Schwartz, B. Lenderts, J.K. Young, and A.M. Cigan. 2016. Genome editing in maize directed by CRISPR–Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications 7:13274.