Биокатализаторы-ферменты

Для живой системы характерны не отдельные химические процессы, а тот закономерный порядок, в котором они осуществляются в клетке организма, а также соотношение отдельных групп процессов, их взаимная координация. В растительном организме физико-химическая среда создается в результате взаимосвязей, с одной стороны, между внешней средой и организмом, а с другой — между многочисленными катализаторами и субстратами внутри организма. $$\newcommand{\water}{{\rm H_{2}O}}$$

Катализаторы в химических реакциях и биокатализаторы в живых организмах значительно ускоряют реакции и облегчают их течение. Если для реакции в условиях химической лаборатории необходимы повышенная температура, большое давление и высокая концентрация реагирующих веществ, то в живом организме она осуществляется при 20-30 °С, давлении, близком к атмосферному, и часто при незначительной концентрации исходных продуктов, с намного большей скоростью, чем в лабораторных условиях.

Весной в пробуждающихся многолетних растениях интенсивно проходят процессы синтеза за счет свободной энергии, которая выделяется при окислении углеводов (сахаров) при температуре несколько выше 0 °С. При таких условиях для реакции необходимы более активные катализаторы, чем применяемые в лабораториях. В живых организмах роль таких катализаторов выполняют сложные белковые молекулы, которые называются биокатализаторами или ферментами (энзимами).

Таким образом, ферменты — это вещества белковой природы, которые образуются в процессе жизнедеятельности организма и своим участием в обмене веществ обеспечивают единство между средой и организмом. Без ферментов нет жизни.

Стоящие перед биологической наукой важные задачи можно решить, только всесторонне и глубоко исследовав белки — ферменты, их структуру, биосинтез и особенности действия при разнообразных внешних и внутренних факторах.

Ферменты подразделяются на одно- и двухкомпонентные. Первые состоят только из молекул белка, вторые — из белковой части, получившей название апофермента , и соединения небелковой природы, называемой простетической группой. В двухкомпонентных ферментах белок-носитель называют также фероном, а небелковую активную группу — агоном. У двухкомпонентных ферментов, небелковая часть которых легко отделяется от апофермента, простетические группы называют коферментами . Размеры кофермента во много раз меньше размеров белковой молекулы (апофермента).

Коферменты ферментов пиридиновых дегидрогеназ — никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ), флавиновых ферментов — флавиннуклеотиды, фермента глицинтрансформиминазы — производные фолиевой кислоты.

Никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ)

Наука о ферментах — энзимология — превратилась в большую отрасль знаний и тесно связана со многими науками. Кроме того, данные ее широко применяются на практике в различных отраслях, например в пивоварении и других бродильных производствах, в борьбе с вредителями сельскохозяйственных культур и т. д. Хотя процессы брожения и пивоварения были известны издавна, первое представление о ферментах возникло в 1814 г., когда действительный член Петербургской академии наук К. Кирхгофф открыл явление превращения крахмала в сахара в высушенном ячменном солоде. В 1833 г. французские химики А. Пайен и Ж. Персо впервые выделили из осадка, образующегося при добавлении спирта к солодовому экстракту, термолабильное вещество, которое обладает способностью превращать крахмал в сахар. Это вещество они назвали диастазой (от греч. diastasis — разделять), сейчас его чаще называют амилазой.

После открытия ферментов многие исследователи обратили внимание на сходство их действия с действием дрожжей при брожении. Во второй половине XIX в. произошел большой спор между знаменитым химиком М. Бертло, который считал, что брожение и подобные процессы обусловлены действием химических веществ, и выдающимся микробиологом Л. Пастером, утверждавшим, что брожение неотделимо от жизнедеятельности, клеток. Эта дискуссия закончилась после того, как немецкому ученому Э. Бухнеру удалось получить ферменты из дрожжевого экстракта, вызывающие брожение даже при отсутствии дрожжевых клеток.

Специфическая деятельность ферментов является одним из важнейших факторов осуществления процессов обмена веществ в организме, их согласованности и направленности *.

_{* Неорганические катализаторы в этом отношении достаточно универсальны. Так, ион водорода катализирует гидролиз тростникового сахара, мальтозы, крахмала, белков и многих других веществ.}

Многочисленные биологические катализаторы в организме — ферменты, отличающиеся исключительной специфичностью и эффективностью действия, ускоряют только определенные превращения данного вещества. Распределение скоростей ферментативных превращений в организме в значительной мере определяет специфичность процессов обмена веществ.

Действия ферментов согласованны: продукты катализа одного фермента поступают к другому, а не рассеиваются в содержимом клетки; реакции, выделяющие энергию, тесно связаны с реакциями, требующими ее затрат. Например, окисление сахаров и жиров происходит с выделением энергии, тогда как для синтеза белков необходимы затраты ее. Связь между реакциями такого типа устанавливается через аденозинтрифосфорную кислоту (АТФ) — химический аккумулятор энергии в удобной для усвоения форме.

Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ)

Аденозинтрифосфорная кислота состоит из органического основания аденина (I), углевода рибозы (II) и трех остатков фосфорной кислоты (III). Соединение аденина и рибозы называется аденозином. Пирофосфатные группы имеют макроэргические связи, обозначенные знаком ~. Разложение одной молекулы АТФ с участием воды сопровождается отщеплением одной молекулы фосфорной кислоты и выделением свободной энергии, равной 33-42 кДж/моль. Все реакции с участием АТФ регулируются ферментными системами.

Ферменты выполняют еще одну очень важную функцию: они защищают организм от ядовитых веществ, угрожающих его нормальной жизнедеятельности. При появлении таких веществ в организме начинают образовываться ферменты, разрушающие их.

Витамины как составная часть ферментов

В состав коферментов многих ферментов входят витамины или их производные. Академик Н. Д. Зелинский отмечал, что связь между ферментами и витаминами, очевидно, заключается в том, что витамины являются строительным материалом для ферментов.

Витамины открыл в 1880 г. русский ученый Н. И. Лунин. Они относятся к группе сравнительно низкомолекулярных органических соединений различного химического строения, необходимых для питания человека и животных, а также для нормальной жизнедеятельности растений и микроорганизмов. Многие витамины и их производные, соединяясь с различными веществами, образуют ферменты. Так, при связывании витамина В₁ в виде фосфорного эфира с белком образуется фермент пируватдекарбоксилаза, который расщепляет пировиноградную кислоту СН₃СОСООН на уксусный альдегид и СО₂.

Витамин В₁

Витамин В₂ (рибофлавин) образует с фосфорной кислотой флавинмононуклеотид, который, соединяясь с адениловой кислотой (нуклеотидом аденозинмонофосфатом), дает флавинадениндинуклеотид, в сочетании, с различными белками входящий в состав ряда окислительно-восстановительных ферментов.

Витамин B₂

Аденозинмонофосфат

Витамин РР (никотиновая кислота) в виде амида входит в состав окислительно-восстановительных ферментов дегидрогеназ, которые катализируют реакции окисления органических веществ с выделением водорода:

Витамин РР

Пантотеновая кислота является составной частью кофермента А*, активирующего синтез лимонной кислоты, жирных кислот и стеролов:
_{* Название «кофермент А» получил благодаря свойственной ему функции ацетилирования—переноса ацетильного радикала СН3СО.}

Пантотеновая кислота

В состав большого числа двухкомпонентных ферментов входят также фосфорилированные производные витамина В₆ (пиридоксина)— пиридоксальфосфат или фосфопиридоксин.

Структурное соответствие ферментов субстратам

Катализируя биохимическую реакцию, фермент образует со своим субстратом промежуточное соединение, которое в процессе реакции распадается, и фермент регенерируется. Промежуточные продукты ряда ферментов хорошо известны и изучены. В частности, установлено структурное соответствие между молекулой субстрата и частью молекулы самого фермента. Оказалось, что атомы в молекуле субстрата и атомы определенных участков ферментов имеют такое расположение, которое лучше способствует реакции, катализируемой ферментом. Молекула субстрата как бы вкладывается в «форму», имеющуюся на поверхности частицы фермента, и испытывает активное воздействие его (рис. 7).

Рис. 7. Схема структурного соответствия фермента субстратам.

Согласно приведенной схеме молекула фермента должна точно соответствовать молекуле субстрата (превращаемого вещества). Этим и обусловливается четкая специфичность ферментов.

Ферменты как белковые молекулы образуются из аминокислот при участии нуклеиновых кислот. Сначала некоторые ферменты продуцируются в форме неактивных белков, которые превращаются в активные под действием того же фермента или ионов водорода. Считают, что процесс активизации белков заключается в гидролизе пептидных связей с отщеплением или без отщепления свободных пептидных цепей и в образовании активного центра.

Делаются попытки синтезировать искусственные ферменты (модели). Так, В. Лангенбек создал активную модель фермента, который разлагает пирогаллол. Окисление пирогаллола в природе катализируется ферментом, в состав которого входит медь. Ученому удалось найти соединения меди, которые действуют значительно сильнее, чем естественные катализаторы.

Создание искусственных ферментов для практики и раскрытие с их помощью сложных и согласованных биохимических процессов, происходящих в различных организмах,— задачи ближайшего будущего.

Теория ферментативного катализа

Специфическое действие ферментов, направленное на определенные химические связи,— одно из их главных свойств. Например, уреаза разлагает только мочевину, но на ее производные не действует, сукцинатдегидрогеназа оказывает действие только на янтарную кислоту, инвертаза — на сахарозу, амилаза — на крахмал и т. д

Многие ферменты содержат активную группу, отличающуюся по своей природе от белка. Это может быть или комплексное соединение металла (железо, медь), или органическое вещество. Соединение белка, субстрата и активной группы часто обеспечивается при участии ионов металлов — кальция, магния, марганца, меди и других, которые своим электрическим полем удерживают компоненты реакции в определенном положении и влияют на химические связи субстрата и фермента.

Теория ферментативного катализа основывается на теории гетерогенного и гомогенного катализа. Примером действия катализатора может быть вода. Смесь водорода и хлора взрывается на свету, образуя хлористый водород. Если же тщательно очистить хлор и водород от самых незначительных остатков водяного пара, то реакции не произойдет.

Механизм действия таких катализаторов, как платина, палладий, заключается в том, что на их поверхности концентрируются молекулы реагирующих веществ. В основу теорий ферментативной кинетики, развитой Л. Михаэлисом, положено допущение, что фермент и субстрат образуют друг с другом активный короткоживущий комплекс, который способен распадаться, на продукты реакции и фермент.

Кинетика каталитического действия фермента определяется главным образом частью молекулы — активным центром; в среднем один центр приходится на 250-500 аминокислотных остатков. Активный центр oднокомпонентных ферментов определяется специфическим пространственным размещением нескольких аминокислотных остатков (цистеина, серина, гистидина и др.). В двухкомпонентных ферментах в состав коферментов входят витамины или их производные, атомы металлов. Природа активного центра и взаимное расположение его компонентов определяют специфичность действия ферментов. Согласно современным представлениям, активный центр ферментов состоит из нескольких участков различной полярной или ионной природы, которые находятся в определенном пространственном расположении.

Таким образом, химические группы фермента, благодаря которым он вступает в соединение с субстратом и оказывает каталитическое действие, называются активным центром фермента. Такие группы расположены в различных участках молекулы фермента и взаимодействуют между собой; они ответственны за каталитическую активность и называются функциональными группами фермента. Нарушение пространственного расположения функциональных групп активного центра при денатурации приводит к инактивации фермента.

Химическая реакция между двумя видами молекул может происходить только тогда, когда молекулы активизированы, т. е., когда они получают дополнительное количество энергии. Катализатор снижает энергию активации, необходимую для осуществления химической реакции, направляет ее как бы «окольным» путем через промежуточные реакции, которые требуют меньшей энергии активации. Например, реакция АВ→А+В в присутствии катализатора К проходит так: АВ + К→АВК и далее АВК→ВК+А и ВК→В + К. Для этих промежуточных реакций необходимо намного меньше энергии активации, чем для реакций, происходящих без участия катализатора. Протекают они со значительной скоростью; которая в суммарной реакции АВ→А + В также значительно повышается. Так, при гидролизе сахарозы с образованием из нее глюкозы и фруктозы без катализатора необходимо 134 кДж на грамм-молекулу; если же реакция катализируется ионами водорода, то энергия активации снижается до 105 кДж, а при катализе сахаразой — до 39 кДж.

Энергия активации субстрата, например сахарозы, под влиянием ферментов снижается вследствие некоторой деформации молекул субстрата, которая происходит при образовании промежуточного комплекса фермент — субстрат. Эта деформация ослабляет внутримолекулярные связи, и молекула становится более способной к определенной реакции. В основе каталитического действия ферментов лежит сильное поляризующее влияние двух или нескольких групп различной природы, входящих в состав активного центра фермента, на реагирующие связи субстрата. К основным факторам, определяющим начальную скорость ферментативной реакции, относятся концентрация ферментов и субстрата, pH, температура и присутствие активаторов или ингибиторов. Для многих ферментов температурный оптимум их действия близок к 37°С.

Ряд ферментов активируются в присутствии соединений, содержащих сульфгидрильную группу (—SH), например цистеин и глутатион. Ингибиторами многих ферментов являются фтористый натрий, который тормозит ферментативные процессы углеводного обмена, фенилгидразин, угнетающий действие аминофераз, синильная кислота — ингибитор ряда ферментов, которые содержат в активной группе железо (каталаза) или медь (тирозиназа). Кроме того, установлено, что соединение некоторых ферментов с белками протопласта приводит к утрате их активности и, наоборот, высвобождение фермента из соединений с белками восстанавливает его каталитическую активность.

В цитоплазме растительной клетки путем связывания ферментов на пластидах, митохондриях и микросомах изменяется активность и направленность их действия.

Примером химического строения ферментов может служить рибонуклеаза. Первый ферментный белок, первичная структура которого была определена в 1960-1962 гг. — рибонуклеаза — фермент, катализирующий расщепление рибонуклеиновой кислоты. В 1969 г. осуществлен его химический синтез. Молекулярная масса кристаллической рибонуклеазы равна 13683. Полипептидная цепь этого фермента состоит из 124 аминокислотных остатков и четырех дисульфидных мостиков, которые, по-видимому, связывают между собой отдельные участки полипептидной цепи рибонуклеазы и поддерживают третичную структуру белка. Концевыми аминокислотами рибонуклеазы являются лизин и валин. Установлено, что каталитическая активность рибонуклеазы зависит главным образом от наличия в ней двух гистидиновых остатков, а молекула фермента свернута таким образом, что эти два аминокислотных остатка — один в начале, другой в конце полипептидной цепи — оказываются в непосредственной близости один от другого. Если блокировать свободную аминогруппу остатка лизина, то также происходит полная потеря каталитической активности фермента. Это свидетельствует о том, что ферментативные свойства рибонуклеазы, а также других ферментов зависят от структуры определенных участков полипептидной цепи и их взаимодействия, т. е. от структуры активного центра фермента.

Известно более 2000 ферментов. Многие из них получены в очищенном виде и около 150 — в кристаллическом. Первый фермент в кристаллическом виде — уреаза — был выделен из бобов сои американским биологом Д. Самнером в 1926 г. Все известные до настоящего времени ферменты являются белковыми веществами. Однако химическое строение их изучено еще недостаточно. Классифицируют ферменты по характеру действия.

В органической химии различают три основных типа химических реакций: замещение, отщепление и присоединение. Из них наиболее распространена реакция замещения, которая происходит по уравнению: \(AB + C \to AC + B\)

В ферментативных процессах преобладают реакции переноса различных групп атомов, которым соответствует уравнение:

В реакциях такого типа одновременно с переносом группы В на D и С на А происходит обмен группами в исходных веществах (в субстрате)— реакции двойного замещения. К ним относятся многочисленные реакции гидролиза или фосфоролиза, в которых осуществляется перенос группы В молекулы субстрата на остаток воды D (D = OH) или фосфорной кислоты. Различные реакции переноса или двойного обмена, преобладающие в биохимических процессах, идут с меньшей суммарной затратой энергии, чем простые реакции замещения.

К группе ферментативных реакций переноса атомных группировок относится специфическая и довольно важная группа окислительно-восстановительных реакций. В биохимических процессах встречаются такие же реакции, как и в органической химии,— реакции отщепления и присоединения.

Единицей (Е) любого фермента называется то количество его, которое при данных условиях катализирует превращение одного микромоля субстрата за 1 мин или одного микроэквивалента затронутых реакцией групп молекул. Определение активности ферментов основывается на начальной скорости реакции, так как вследствие образования ингибирующих продуктов или обратного действия реакции скорость ее заметно снижается. Концентрацию фермента в растворе выражают в единицах активности на 1 мл раствора.

Удельная активность фермента определяется в единицах его на 1 мг белка моль/мин×мг , а молекулярная активность соответствует количеству единиц в одном микромоле фермента, т. е. количеству молекул субстрата, которые превращаются за 1 мин одной молекулой фермента.

Международный биохимический союз рекомендует новую единицу — катал, показывающую количество фермента, которое катализирует превращение 1 моля субстрата в продукт за 1 с.

Если фермент имеет простетическую группу или каталитический (активный) центр, то его каталитическую силу и активность этого центра выражают количеством молекул субстрата, которые превращаются за 1 мин одним каталитическим, центром.

Основным уравнением кинетики действия ферментов является уравнение Михаэлиса — Ментен: $$\large \upsilon = V \frac{[S]}{Km+[S]}$$

где ʊ — скорость ферментативных реакций; V — максимальная скорость реакции; Кm — константа Михаэлиса; [S] — молярная концентрация субстрата.

Максимальная скорость ферментативной реакции достигается при такой концентрации субстрата, при которой весь фермент вступает в реакцию. Константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции достигает половины максимальной скорости V; Кm, как и концентрацию субстрата, выражают в молях (рис. 8).

Константы скоростей отдельных промежуточных стадий ферментативной реакции нумеруют, и уравнение со всеми константами скоростей можно записать так: $$\large \ce{E + S\: <=>[{k+1}][{k-1}]\: ES\: <=>[{k+2}][{k-2}]\: EP\: <=>[{k+3}][{k-3}]\: E + P,}$$
где E — фермент; S — субстрат; ES и EP — промежуточные соединения фермента с субстратом; Р — конечный продукт; k — константы скоростей.

На международной конференции химиков в Риге в 1970 г. американский ученый Д. Кошленд предложил гипотезу о действии ферментов. Суть ее заключается в том, что ферменты «выстраивают» наиболее отдаленные от центра атома электроны, которые вращаются вокруг ядра так, что они могут легко связываться с другими атомами. Ферменты, по мнению Кошленда, эффективны потому, что придают атомам молекул определенную ориентацию для соединения или разъединения в реакциях.

Большинство реакций, катализируемых ферментами, обратимы. Например, фумараза катализирует гидратацию фумаровой, кислоты до яблочной и наоборот $$\underset{\text{фумаровая кислота}}{\ce{HOOC\bond{-}CH\bond{=}CH\bond{-}COOH + H_2O}} \rightleftarrows \underset{\text{яблочная кислота}}{\ce{HOOC\bond{-}CH_2\bond{-}CHOH\bond{-}COOH}}$$

Согласно теории Д. Холдейна, обратимость действия ферментативных реакций объясняется следующим образом. Соединение АВ гидролизуется: $$\small AB + H_2O \rightleftarrows AH + BOH$$

При обратной реакции — дегидратации — вещества АН и ВОН должны соединяться с соответствующим центрами а и b фермента. Расстояние между ними при гидратации несколько увеличилось, поэтому возникает определенное напряжение между - А и В, которые, соединяясь, выталкивают Н и ОН в виде молекулы воды. В большинстве случаев каждая молекула фермента в этот момент взаимодействует с одной молекулой субстрата, катализирует соответствующую химическую реакцию, освобождает продукт, а затем начинает все сначала с другой молекулой субстрата. Этот процесс повторяется миллионы раз до тех пор, пока не будет использован весь запас субстрата или пока молекула фермента не разрушится. Продолжительность действия клеточных ферментов от нескольких дней до нескольких лет. В итоге все они разрушаются протеолитическими ферментами, и аминокислоты, входившие в их состав, могут быть использованы для синтеза других белковых молекул.

Необходимые условия осуществления ферментативного катализа:

• высокая степень соответствия и сродства фермента и субстрата, т. е. образование комплекса фермент—субстрат (эффект сближения);
• строгая взаимная ориентация субстрата, кофакторов и активного центра фермента (эффект ориентации);
• активация субстрата, перераспределение электронной плотности под действием электроактивиых групп (эффект поляризации).

Рис. 8. Зависимость начальной скорости (ʊ) ферментативной реакции от концентрации субстрата (S).

Классификация ферментов и их особенности

Международным биохимическим союзом в 1961 г. принята новая классификация ферментов, согласно которой ферменты подразделяются на шесть классов:

• оксидоредуктазы — окислительно-восстановительные ферменты;
• трансферазы, катализирующие перенос различных групп;
• гидролазы, катализирующие реакции гидролиза с участием воды;
• лиазы, катализирующие присоединение каких-либо групп по месту двойной связи или, наоборот, отщепление групп с образованием двойной связи;
• изомеразы;
• лигазы (синтетазы), катализирующие образование связей С—О, С—N, С—S, С—С с потреблением энергии макроэргических связей АТФ.

Название ферментам дают по названию реакции, которую они катализируют, или по названиям субстратов, превращения которых катализируют ферменты, с добавлением к этим названиям в большинстве случаев окончания «аза», например амилаза, сахараза, липаза и т. д.

Каждый из перечисленных классов делится на подклассы и подподклассы в соответствии с особенностями субстратов, превращение которых катализируется данной подгруппой ферментов. В основу международной классификации ферментов положен принцип, устанавливающий тип катализируемой реакции, т. е. катализируемая химическая реакция является тем признаком, который отличает один фермент от другого.

Название соответствующего типа катализируемой реакции в сочетании с названием субстрата является основой названия отдельных ферментов. Например: гидролазы эфиров карбоновых кислот, гидролазы гликозидов, пептидгидролазы и т. д.; лигазы, аминокислот, лигазы кислотно-тиоловые, лигазы кислотно-аммиачные, лигазы, образующие аминоацил — РНК и др.; оксидоредуктазы, действующие на СН—ОН-группу доноров; оксидоредуктазы, действующие на CHNH₂-гpуппу доноров и т. д.; углерод-углерод-лиазы, углерод-кислород-лиазы, углерод-азот-лиазы и т. д.

1. Оксидоредуктазы. К этому классу относятся ферменты, которые катализируют перенос атомов водорода и электронов, (процессы дыхания, брожения): дегидрогеназы, каталаза, пероксидазы, оксидазы, липоксигеназа, цитохромная система.

Дегидрогеназы катализируют окислительно-восстановительную реакцию переноса водорода от субстрата AН₂ к акцептору В:

AH₂+B ⇄ A+BH₂

Каталаза — широко распространенный фермент; обнаружен у животных, растений и всех аэробных бактерий. Катализирует реакцию разложения перекиси водорода на воду и молекулярный кислород:

2H₂O₂ → 2H₂O₂+O₂

Кристаллическая каталаза содержит 0,09% железа, или четыре атома его на молекулу фермента.

Пероксидазы катализируют окисление различных полифенолов, алифатических и ароматических аминов, а также жирных кислот (пероксидаза жирных кислот), цитохрома (цитохромпероксидаза), глутатиона (глутатионпероксидаза). Реакция окисления осуществляется с помощью перекиси водорода (Н₂О₂) или органической перекиси. С перекисью водорода пероксидаза образует комплексное соединение, в результате перекись активируется и действует как акцептор водорода:

Пероксидазы, выделенные из разных источников, различаются молекулярной массой и субстратной специфичностью. Пероксидаза, полученная из хрена, имеет молекулярную массу 44100. Кофактором пероксидазы являются ионы марганца. Пероксидазы играют важную роль в дыхании растений. Каталаза и пероксидаза — типичные представители группы ферментов, содержащих железопорфириновые коферменты.

Оксидазы — аэробные дегидрогеназы, для которых акцептором водорода может быть только кислород воздуха:

AH₂+½O₂ ⇄ A+H₂O

Липоксигеназа катализирует окисление кислородом воздуха некоторых ненасыщенных высокомолекулярных жирных кислот, сложных эфиров, образуемых этими кислотами, и каротина.

Цитохромная система состоит из ряда цитохромов (а, Ь, с, d, f) и фермента цитохромоксидазы, который активирует молекулярный кислород и окисляет с его помощью восстановленный цитохром. Цитохромы — это протеиды, содержащие железо в виде гемажелезопорфиринового комплекса. Они существуют в окисленной и восстановленной формах, которые легко взаимопревращаются. При таких превращениях изменяется валентность железа, содержащегося в цитохромах. При окислении закисная форма железа переходит в окисную:

Fe⁺² → Fe³⁺ — окисление;

Fe⁺² → Fe²⁺ — восстановление

Роль цитохромов в живой клетке заключается в том, что окисленная форма цитохрома отнимает электрон от атомов водорода. Атом водорода отчуждается дегидрогеназой от окисленного субстрата, в результате чего превращается в ион водорода Н⁺, а электрон передастся молекуле кислорода, который способен реагировать с Н⁺ , образуя молекулу воды.

2. Трансферазы (ферменты переноса) катализируют перенос целых атомных групп (остатков фосфорной кислоты, моносахаридов и аминокислот, аминных или метильных групп и т. д.) от одного соединения к другому. Например, аминоферазы:
HOOCCH₂CHNH₂COOH + CH₃COCOOH ⇄ CH₃CHNH₂COOH + НООССН₂СОСООН; фосфоферазы: АТФ+глюкоза ⇄ АДФ + глюкозо-6-фосфат.

Гликозилтранеферазы — ферменты, катализирующие перенос остатков моносахаридов. К ним относятся и фосфорилазы, которые обеспечивают перенос гликозильного остатка на фосфорную кислоту.

3. Гидролазы катализируют расщепление сложных органических соединений на более простые с присоединением воды. Подобное расщепление называют гидролизом. Гидролазы катализируют реакции, которые можно выразить общим уравнением

RR₁+HOH ⇄ ROH+R₁H

Класс гидролаз подразделяется на девять подклассов. Главнейшие представители этого класса: липаза — фермент, катализирующий гидролиз жиров; пектин-эстераза, или пектаза, катализирует расщепление растворимого пектина на метиловый спирт и полигалактуроновую кислоту; α- и β- амилаза — расщепляют крахмал до декстринов и мальтозы; фруктофуранозидаза (инвертаза, или сахараза) — расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу; целлюлаза — гидролизует целлюлозу до целлобиозы и глюкозы; протеолитические ферменты (протеазы) — катализируют гидролиз пептидов и белков.

Фермент АТФ-аза (аденозинтр и фосфатаза ), систематическое название — АТФ-фосфогидролаза (3.6.1.3) катализирует реакцию

АТФ+Н₂О = АДФ+ортофосфат

АТФ-азная активность стимулируется ионами Mg²⁺, Са²⁺, Na⁺, К⁺ Существует несколько форм АТФ-аз.

Фосфатазы — ферменты, катализирующие расщепление сложных эфиров фосфорной кислоты. Содержатся в различных тканях и клетках, гидролизуют моно- и диэфиры фосфорной кислоты. Фосфатазы различаются по оптимальной для их действия pH среды: щелочные (pH около 9), нейтральные (pH 5-6) и кислые (pH 3-4).

4. Лиазы. К этому классу принадлежат ферменты, катализирующие реакции негидролитического отщепления каких-либо групп от субстрата (или присоединение к нему). Они обусловливают отщепление групп с образованием двойных связей или присоединение их по месту двойной связи молекулы.

К лиазам относятся энолазы, которые превращают 2-фосфоглицериновую кислоту в фосфоенолпировиноградную:

Рибулозодифосфаткарбоксилаза (оксигеназа) — важнейший фермент фотосинтеза и фотодыхания, выделен из листьев шпината. Молекулярная масса 550000. Фермент (сокращенно РДФК) достоит из 16 субъединиц: 8 больших субъединиц синтезируются в хлоропласте и образуют активный центр, а 8 малых единиц — в цитоплазме. Содержание РДФК в листьях очень высокое — 16% общего количества белка в них.

Оксигеназная функция РДФК открыта в 1971 г. При оксигеназной реакции (pH 8 и выше) рибулозо-1,5-дифосфат расщепляется на фосфогликолат и 3-фосфоглицериновую кислоту.

Декарбоксилаза, катализирующая декарбоксилирование, расщепление с выделением СО₂: $$\large \underset{\text{щавелевоуксусная кислота}}{\ce{H \fbox{OOC}CH_2COCOOH}} \Rightarrow \underset{\text{пировиноградная кислота}}{\ce{CH_3COCOOH + CO_2}}$$

Альдолазы вызывают распад фруктозодифосфата на фосфодиоксиацетон и фосфоглицериновый альдегид (дыхание).

5. Изомеразы, катализируют реакции изомеризации различных органических соединений, которые играют важную роль в обмене веществ:

6. Лигазы (синтетазы) катализируют, соединение двух молекул с потреблением энергии макроэргических связей АТФ: $$\large \underset{\text{глутаминовая кислота}}{\ce{АТФ + HOOCCH_2CH_2CHNH_2COOH + NH_3 = АДФ + H_3PO_4}} +$$ $$\large + \underset{\text{глутамин}}{\ce{/H_2N/OCCH_2CH_2CHNH_2COOH}}$$

Для всех ферментов установлен цифровой четырехзначный: шифр. Первая цифра указывает, к какому из шести классов- принадлежит фермент; второй цифрой обозначается подкласс; третьей — подподкласс и четвертой — порядковый номер фермента в данном подподклассе. Например, шифр 3.1.1.14 обозначает: класс третий — гидролазы; подкласс первый — действует на сложноэфирные связи; подподкласс первый — гидролазы эфиров карбоновых кислот, цифра 14 соответствует систематическому названию фермента хлорофиллидогидролаза хлорофиллов (хлорофиллаза), который катализирует реакцию: хлорофилл + Н₂О = фитол + хлорофиллид.

Изоферменты

Уже давно было замечено, что ферменты, катализирующие одну и ту же химическую реакцию, имеют одинаковую субстратную специфичность, но, будучи полученными из разных органов и тканей, различаются по своим свойствам. В 50-х гг. нашего столетия О. Варбург показал, что альдолазы (из класса лиаз), которые были выделены из дрожжей и животных тканей, обладают разными свойствами: а-амилазы из слюны и поджелудочной железы человека идентичны, но различаются растворимостью, оптимумом pH и другими свойствами. Методом электрофореза на крахмальном геле были обнаружены также множественные формы пероксидаз в зерне злаковых растений.

Следовательно, ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию в разных тканях, могут иметь определенную органо­специфичность. Почти каждый фермент, ускоряющий определенную реакцию, может быть одновременно представлен в клетке несколькими разными по своей природе белками-ферментами. Их можно отделить друг от друга с помощью электрофореза, фракционирования растворами солей и т. д.

Разнообразные молекулярные формы фермента данного организма, катализирующие одну и ту же реакцию, но различающиеся по своим физическим и химическим свойствам, называются изоферментами (изоэнзимами). Ферментов, множественность молекулярных форм которых известна, около 50. Обнаружены изоферменты алкогольдегидрогеназы, пероксидазы, каталазы, амилазы, инвертазы и т. д.

Считают, что синтез каждого изоэнзима контролируется отдельным структурным геном. Со сменой дифференциации и специализации клеток изменяется и относительная активность генов. При этом в каждой ткани образуется свойственный ей набор изоэнзимов, т. е. белков с разной первичной структурой данного фермента. По-видимому, наличие в клетке нескольких изоферментов, катализирующих одну и ту же реакцию, но различающихся по ряду свойств, способствует приспособляемости растительного организма к условиям существования.

Конститутивные и адаптативне ферменты

Различные ферменты содержатся в клетке в неодинаковых количествах. Чем меньше размеры клетки, тем меньше в ней молекул данного фермента. Ферменты, которые тесно связаны с основными путями обмена, т. е. с химическими реакциями, происходящими непрерывно, содержатся обычно в растениях в сравнительно высоких концентрациях, а ферменты, которые принимают участие в метаболических процессах второстепенного значения или в эпизодических реакциях,— в относительно малых количествах. Для многих основных серий реакций необходимо определенное молекулярное соотношение между отдельными ферментами, катализирующими каждую из реакций. Поэтому такие ферменты имеются в клетках всегда или в одинаковых, или в кратных концентрациях (1:1, 1:2, 1:3 и т. д.). Молекул какого-либо фермента, катализирующего основную реакцию, может быть в клетке тысячи, тогда как молекул фермента, который катализирует реакцию, находящуюся в стороне от основных направлений метаболизма,— не более нескольких сотен.

В клетках имеются две категории ферментов. Первая — конститутивные ферменты. Это обязательные компоненты растительной клетки. Вторая категория ферментов — адаптивные, которые или синтезируются заново, или образование их резко усиливается вследствие адаптации растительного организма к условиям окружающей среды. Адаптивные ферменты называют также индуцированными, потому что к ним принадлежат и такие, образование которых у одного организма может быть вызвано или значительно ускорено тем или иным веществом. Нитратредуктаза и гидроксиламинрёдуктаза в растениях — индуцированные ферменты, их синтез значительно усиливается при введении в ткани растений соответственно нитрата или гидроксиламина. К индуцированным ферментам относится также пенициллиназа — очень активный фермент, свойствен устойчивому к пенициллину штамму бактерий, быстро расщепляет пенициллин и, следовательно, делает его неактивным.

Некоторые вещества не индуцируют образование ферментов, а ингибируют его. Ферменты, синтез которых угнетается теми или иными соединениями, называют репрессированными. Типичным соединением, неспецифично подавляющим синтез ферментов, является глюкоза. Она угнетает образование микроорганизмами ряда ферментов, например α-амилазы и триптофаназы — фермента, который катализирует расщепление амино­кислоты триптофана.

Однако существуют более специфические виды репрессии синтеза ферментов. Конечный продукт ферментативной реакции может репрессировать образование фермента, который катализирует данную реакцию. В качестве примера можно назвать хорошо исследованный фермент триптофансинтетаза, который репрессируется конечным продуктом реакции — триптофаном,

Реакция типа индол-серин ^{триптофансинтетаза}⟶ называется механизмом обратной связи. В цепи ферментативных реакций

конечный продукт (Г) ингибирует синтез, действуя на активный центр ферментов (Ф₁ Ф₂, Ф₃), которые катализируют отдельные этапы его образования.

Конечный или промежуточный продукт ферментативной реакции может влиять на фермент как регулятор, но не на активный центр, а на аллостерический участок (от греч. alios — другой, stereos — структурный, пространственный), вызывая конформационные (структурные) изменения фермента. Взаимодействие аллостерического участка молекулы фермента и его активного центра называется аллостерическим взаимодействием, а ферменты называются аллостерическими.

Таким образом, живой организм способен к саморегуляции, которая осуществляется двумя путями: регулированием синтеза ферментов и регулированием его активности.

Интересны так называемые иммобилизованные ферменты, которые связываются каким-либо носителем, образующим с ним нерастворимый комплекс.

При подборе соответствующего носителя можно получить, иммобилизованный фермент с высокой активностью, устойчивый к денатурирующим агентам. Так, фермент химотрипсин класса гидролаз содержится в секрете поджелудочной железы животных и человека. Он расщепляет белки и пептиды. Прикрепленный химически ковалентной связью к капроновой нити, обладающей механической упругостью, приобретает высокую активность. Растягивая капроновую нить, можно регулировать активность фермента в широких пределах. Свойства фермента при этом изменяются: в несколько раз повышаются его стабильность, устойчивость к воздействию высоких температур. Стало возможным регулировать активность фермента, меняя свойства окружающей среды. Так, при добавлении к субстрату NaCl, которая увеличивает ионную силу раствора, активность фермента повышается в 2-3 раза.

Иммобилизованные ферменты представляют значительный интерес для биохимических исследований, пищевой промышленности и медицины.

Особености действия ферментов в живой ткани растения

Широкие исследования действия ферментов в организмах были начаты в 1935 г. А. И. Опариным, Н. М. Сисакяном и другими учеными в Институте биохимии АН СССР. Эти работы дали начало новому направлению — биохимии ферментов.

Советские ученые открыли ранее неизвестные закономерности действия ферментов в живых организмах. Это дало возможность понять многие особенности обмена веществ, ассимиляции и диссимиляции, выяснить внутренние биохимические закономерности, взаимодействие растений со средой и создать новую отрасль биохимии — функциональную биохимию растений.

Исследованиями установлено, что в семенах, которые находятся в состоянии покоя, ферментов немного. Во время прорастания количество их увеличивается, достигает определенного максимума и затем вновь уменьшается. Так, в прорастающих семенах пшеницы содержание каталазы достигает максимума на 3-4-й день, наибольшее количество всех ферментов наблюдается на 6-8-й день; в прорастающих семенах подсолнечника активность всех ферментов достигает максимума на 6-7-й день. В процессе созревания семени, как и при прорастании, содержание ферментов в нем сначала увеличивается, достигает определенного максимума и затем уменьшается. В созревших семенах фермент находится в зимогенном, или неактивном, состоянии.

В процессе развития сахарной свеклы, наблюдается равномерное снижение активности инвертазы в хлоропластах листьев. По мере их старения количество ферментов в пластидах уменьшается, но активность инвертазы корней резко возрастает. Очевидно, это явление связано с переходом ферментов из структур пластид на другие клеточные элементы и структуры. Одновременно с перераспределением ферментов в растении происходит и их новообразование. Следовательно, наряду с обменом пластическими веществами между отдельными органами растений осуществляется также и обмен ферментами. Известно много экспериментальных данных, которые свидетельствуют о том, что в ходе жизнедеятельности под влиянием изменяющихся условий ферменты образуются, изменяются, а затем утрачивают свои каталитические свойства.

Функции зеленых пластид обусловливаются разнообразием ферментных систем, содержащихся в них. По данным Н.М. Сисакяна, ферменты в пластидах находятся в связанном с протеидами состоянии. Для освобождения их необходим разрыв связи ферментов с протеидным комплексом пластид. Природа этих связей неодинакова у разных ферментов, и, что очень важно, они подвержены закономерным изменениям в зависимости от физиологического состояния организма. На направленность и активность действия ферментов влияют такие факторы, как обезвоживание, охлаждение, увеличение осмотической концентрации, изменения pH, автолиз и др. Например, инвертаза закреплена на протеидном комплексе пластид минимум двумя типами связей, причем значительное количество ферментов связано с пластидами непрочно, а остальные — более прочно. Нарушение периода покоя сахарной свеклы, содержащей инвертазу, этиоляция и замораживание растений способствуют образованию непрочных связей ферментов с протеидным комплексом пластид, а процесс фотосинтеза — наоборот, прочных.

Биохимическая активность пластид коренным образом изменяется с изменением их морфологической структуры, возникающей под влиянием тех или иных факторов, что определяет и активность ферментов. В связи с этим довольно интересны данные о ферментативных особенностях митохондрий, которые, как и пластиды, содержат большое количество разнообразных ферментов. В митохондриях сосредоточены ферментные системы, при участии которых происходят превращения различных веществ. Существует определенная взаимная обусловленность, между формой и функцией, между структурами и их динамической активностью. В процессе развития растений и взаимодействия растительного организма со средой способность ткани к адсорбции ферментов может изменяться сравнительно легко.

Таким образом, биокатализаторы-ферменты возникают в процессе развития растительного организма, обеспечивают адаптацию его к внешним условиям и обусловливают связь между внутренней и внешней средой.

При обезвоживании растительных тканей изменяется направленность действия ферментов в сторону гидролиза и задерживаются все синтетические процессы. Поэтому понятно, что засуха вызывает задержку роста растений. Ростовые процессы некоторое время угнетаются и после возобновления нормальной обводненности тканей, так как изменение направленности ферментов на синтетическую деятельность происходит не сразу. Засухоустойчивые сорта сельскохозяйственных культур даже в условиях значительного водного дефицита характеризуются синтетической направленностью работы ферментов, тогда как у менее засухоустойчивых сортов преобладает гидролитическая направленность.

Одним из показателей иммунности растительных тканей является активность окислительных ферментов, например пероксидазы. При повышении активности окислительных ферментов- растения-хозяина активность гидролитических ферментов мицелия гриба-паразита будет угнетаться. Кроме того, окислительные ферменты способствуют окислению токсинов, выделяющихся микроорганизмами-паразитами, и активируют процессы окисления фенолов до хинонов, создавая тем самым в тканях растения химический «барцер» против паразитов. Все это свидетельствует о большом физиологическом значении ферментов в жизни растений.