В живых пластидах хлорофилл находится в связанном с белками состоянии. Это впервые было установлено исследованиями М. С. Цвета и В. Н. Любименко, которые назвали такой комплекс хлороглобином. Связь хлорофилла с белками в живой клетке подтверждается тем, что его трудно получить из высушенных листьев, присутствии воды гидролитический нений отделение белков от пигментов. После этого пигмент становится растворимым в спирте, бензине и других растворителях. Работы А. Н. Теренина и А. А. Красновского показали, что хлорофилл в листе находится в состояниях агрегации и адсорбции; это зависит от внешних и внутренних условий деятельности хлоропласта.
Рис. 29. Спектры поглощения фикоцианина(1) и фикоэритрина(2).
Одним из наиболее обоснованных доказательств особого состояния пигментов в живой клетке является расхождение их оптических свойств со свойствами раствора тех же пигментов. Максимум поглощения света хлорофиллом и другими пигментами в живой клетке сильно смещен в длинноволновую область по сравнению с максимумом поглощения его пигментами, находящимися в растворе. Установлено, что фотохимическая активность хлорофилла в растворе изменяется параллельно со способностями к флуоресценции, максимальное проявление которой, как правило, указывает на мономолекулярную дисперсность. В листе хлорофилл частично находится во флуоресцирующей мономолекулярной форме. Менее прочно связан с белками хлорофилл молодых листьев. Установлена также способность белков хлоропластов связывать хлорофилл тем больше, чем выше степень их восстановленности. Экспериментально доказано, что восстановление белковых препаратов водородом приводило к повышению их способности связывать хлорофилл.
На основании наблюдений за окраской растительных органов можно сделать вывод о значительных изменениях содержания пигментов в онтогенезе растений: количество хлорофилла и каротиноидов постепенно увеличивается до цветения и уменьшается к концу вегетации.
Ф. В. Турчиным и другими исследователями доказано, что в живых листьях происходит обновление хлорофилла. Скорость этого процесса может быть различной. В большой мере она зависит от особенностей растения. Значительное влияние на нее оказывают внешние условия и физиологическое состояние ткани. В онтогенезе наблюдается постепенное замедление процесса обновления хлорофилла, на который влияют условия освещения, температуры и минерального питания. С помощью меченого азота установлено, что у всходов овса за первые сутки обновляется 26,5%, а за трое суток — 95% хлорофилла, у 25-дневных растений овса за двое суток отмечается обновление 39,7, а во время колошения — лишь 25% хлорофилла. При недостатке калия у молодых растений овса количество обновленного хлорофилла снизилось за двое суток до 34%, а при достаточном количестве этого элемента обновилось до 57,5%.
Синтезу молекулы хлорофилла в клетке растения предшествует ряд реакций, которые изучены еще недостаточно. Значительная часть реакций этого типа происходит в растении даже в тех условиях, когда оно еще не приобрело зеленой окраски.
Н. А. Монтеверде и В. Н. Любименко установили, что в этиолированных проростках, которые не зеленеют в темноте (известны растения, проростки которых зеленеют в темноте), образуется своеобразный пигмент, имеющий некоторое сходство с хлорофиллом. Содержание этого пигмента очень незначительно, и присутствие его можно установить лишь спектроскопическим методом.
К. А. Тимирязев, а позже Н. А. Монтеверде и В. Н. Любименко высказали предположение о существовании в этиолированных растениях пигмента — предшественника хлорофилла, превращающегося под действием света в хлорофилл. К. А. Тимирязев дал ему название протофиллин, а Н. А. Монтеверде — протохлорофилл (голохром). Однако Г. Рудольф и ряд других исследователей пришли к выводу, что пигмент, содержащийся в этиолированных проростках, нельзя полностью признать предшественником хлорофилла, что одновременно с процессом накопления хлорофиллов уменьшения количества протохлорофилла иногда не происходит. У этиолированных растений, выставленных на свет, в первый момент из зеленых пигментов появляется лишь хлорофиллид α — C32H30ON4Mg ∙ COOH × СООСН3. Затем под действием света и фермента хлорофиллазы к хлорофиллиду присоединяется фитол, в результате чего образуется хлорофилл α. Предшественником хлорофиллида является протохлорофиллид — магнийвинилфеопорфирин-α5-монометиловый эфир (С32Н28ОN4Mg ∙ СООН ∙ СOОСН3), который может синтезироваться в темноте.
В настоящее время общепризнано, что протохлорофилл этиолированных и зеленых растений является смесью двух соединений: Mg-винилфеопорфирин-α5-монометилового эфира (С32Н28ОN4Mg ∙ СООН ∙ СOОСН3), названного протохлорофиллидом, и Mg-винилфеопорфирин-α5-метилфитолового эфира (С32Н28ОN4Mg ∙ СООCН3 ∙ COOC20H39), т. е., как понимали раньше, протохлорофилла. Эти соединения называются также «бесфитольной» и «фитольной», или «кислой» и «нейтральной», формами протохлорофилла.
Таким образом, биосинтез хлорофилла может осуществляться двумя путями: 1) протохлорофиллид → протохлорофилл → хлорофилл; 2) протохлорофиллид→ хлорофиллид → хлорофилл. В этиолированных растениях бесфитольная форма протохлорофилла преобладает по сравнению с протохлорофиллом, содержащим фитол.
Новейшие данные дают возможность считать, что именно протохлорофиллид является главным предшественником хлорофилла в растениях. Конечный этап биосинтеза хлорофилла выражается такой схемой: протохлорофиллид → хлорофиллид α → хлорофилл α → хлорофилл b. При освещении растений происходит присоединение водорода к Mg-винилфеопорфирин-α5-монометиловому эфиру с образованием хлорофиллида α. Под действием фермента хлорофиллазы в темноте хлорофиллид а этерифицируется фитолом и образуется хлорофилл α, а из него — хлорофилл b.
Фермент хлорофиллаза, активирующий реакцию присоединения фитола к предшественнику хлорофилла и отщепление его, был открыт в 1908 г. Р. Вильштеттером и М. Бенцем. Он локализован в хлоропластах в хлорофилл-белковых комплексах обеих фотосистем. Е. Г. Судьина высказала предположение, что синтетическая и гидролитическая направленность действия хлорофиллазы определяется молекулярной организацией системы, а также доступностью и изоляцией соответствующих субстратов (хлорофиллид, фитол, хлорофилл). Фитол — одно из самых гидрофобных веществ клетки и может достигать фермента только в случае липидного окружения. Хлорофилл — дифильное соединение, размещающееся на границе раздела фаз, и вступает в гидрофобное взаимодействие с соответствующим компонентом с помощью своего фитольного «хвоста». Собственно, в этом заключается эволюционный смысл реакции этерификации хлорофиллида фитолом.
Специальные модельные эксперименты показали, что в случае гидрофобного окружения фитольного «хвоста» хлорофилла он оказывается изолированным от гидролитического действия хлорофиллазы. Исследования нативных систем позволили установить, что ферментативному гидролизу хлорофилла должно предшествовать нарушение организации структурных компонентов комплекса (Е. Г. Судьииа). Установлено также, что молекулы хлорофиллазы в нативных системах неоднородно связаны со структурными компонентами комплекса и для их экстрагирования требуются различные концентрации солей и детергентов (адсорбционно-активные вещества), часть фермента десорбировать не удается.
На различных объектах прослежена закономерность динамики состояния хлорофиллазы. Нативные и модельные эксперименты указывают на большую активность легкорастворимой фракции фермента. С помощью специального подбора носителей для иммобилизации хлорофиллазы было установлено, что фермент способен как к гидрофобному, так и к ковалентному взаимодействию со структурными компонентами. Активность его при этом зависит от непосредственного молекулярного окружения в системе (Е. Г. Судьина и др.).
Совершенствование аналитических методов позволило обнаружить в некоторых растениях наряду с обычным хлорофиллом пигмент, содержащий вместо фитола геранилгераниол. В результате возникло представление об этерификации хлорофиллида геранилгераниолом, а затем уже о восстановлении последнего до фитольного остатка.
В настоящее время продолжаются исследования субстратной специфичности хлорофиллазы и возможной множественности ее форм, зависимости направленности ее действия и активности от организации системы и молекулярного окружения, а также поиски промежуточных продуктов заключительного этапа биосинтеза хлорофилла.
Продуктивность использования света в процессе синтеза хлорофилла значительно повышается, если растение освещается не постоянным, а прерывистым светом, причем хлорофилла образуется больше, если темновой интервал будет продолжительнее. Например, за 1 ч в 1 кг свежих листьев при постоянном освещении образовалось 11 мг хлорофиллов, а при чередовании в течение 1 ч 1 мин света и 3 мин темноты — 92 мг, 1 мин света и 19 мин темноты — 342 мг. Следовательно, в процессе образования хлорофилла использование света чередуется с химическими темновыми реакциями.
По Т. Н. Годневу, порфириновое ядро образуется в результате конденсации пиррола с муравьиным альдегидом. Что касается гидрофобной части молекулы хлорофилла — фитола, то она создается из углеводородных цепей каротиноидов, что подтверждает генетическую связь между зелеными и желтыми пигментами. Имеется ряд данных, свидетельствующих о том, что уменьшение содержания желтых пигментов сопровождается повышением количества зеленых.
Скорость позеленения этиолированных проростков зависит от содержания в тканях достаточного количества углеводов, в частности сахаров. Условия минерального питания также имеют большое значение для образования хлорофилла, особенно важна роль железа, при недостатке которого растения заболевают хлорозом. Железо участвует в окислительных процессах при синтезе как предшественников, так и самого хлорофилла. Известно также, что отсутствие в питательной среде марганца, меди, серы, азота, калия и других элементов задерживает образование хлорофилла, вызывает появление хлороза.
Очевидно, без этих элементов минерального питания нарушаются ферментативные процессы биосинтеза пигментов.
Все приведенные факты свидетельствуют о том, что образование и распад хлорофилла в живой клетке связаны со сложным комплексом процессов обмена веществ. Основные условия образования хлорофилла — наличие пластид, способных к позеленению, и свет. Кроме того, доказано, что процесс биосинтеза пигментов тесно связан с синтетической деятельностью корней. На биосинтез фотосинтетических пигментов (хлорофилла и каротиноидов) положительно влияют и гуминовые кислоты. Как считает Л. А. Христева, гуматы повышают энергетический потенциал растительных синтетаз, являются переносчиками водорода и активаторами кислорода.
В 1960 г. почти одновременно в лабораториях М. Штрелля (ФРГ) и Р. Вудворда (США) был осуществлен полный синтез хлорофилла. Двухъядерные вещества диперил-метанов были соединены в четырехъядерную систему типа порфиринов, а также вызван их переход в форбинную систему. На основании сравнения биосинтеза и полного синтеза хлорофилла следует отметить, что условия реакции химического синтеза хлорофилла и биосинтеза, как и природа этих реакций, неодинаковы. Химический синтез осуществляется при 100-200°С под влиянием очень активных реактивов, тогда как биосинтез хлорофилла под влиянием ферментов идет при обычной температуре. Характер реакций также различный, но общей для обоих видов синтеза является стадия пиррольных ядер.