В последнее десятилетие в СССР и за рубежом интенсивно ведутся исследования явления флуоресценции и первичных процессов фотосинтеза у высших и низших зеленых растений в связи с их физиологическим состоянием.
Известно, что молекула хлорофилла, находящаяся в электронно-возбужденном состоянии, может потерять свою энергию, вернувшись в основное состояние, несколькими способами. Один из них состоит в испускании молекулой кванта света — флуоресценция (люминесценция)*.
*Энергия электронов при переходе из возбужденного состояния в основное может выделяться различными путями: 1) потеря в виде тепла; 2) в виде излучения (флуоресценция); 3) фотохимическая работа (в РЦ); 4) возбуждение соседних молекул (перенос энергии к фотохимическим центрам).
По механизму преобразования энергии возбуждения флуоресценция, как правило, является спонтанной люминесценцией, поэтому длительность \((\tau)\) ее определяется периодом существования на возбужденном уровне с временем послесвечения 10-8 - 10-9 с.
Абсолютную интенсивность испускаемого света и спектральные свойства флуоресцентного излучения определяют методом флуоресцентной спектроскопии. Несмотря на то что интенсивность флуоресценции чрезвычайно мала, чувствительность метода значительно выше, чем при измерении поглощения света. Флуоресцентная спектроскопия относится к числу важных аналитических методов.
Для оценки эффективности работы фотосинтетического аппарата растений и устойчивости его к различным внешним воздействиям разработаны методы учета интенсивности замедленной флуоресценции (Д. Н. Маторин, П. С. Венедиктов, А. Б. Рубин, А. А. Красновский, В. С. Маренков, И. Р. Васильев и др.).
Замедленная флуоресценция (ЗФ) фотосинтезирующих организмов, открытая в 1951 г. Б. Стрелером и В. Арнольдом (США), в настоящее время широко используется при изучении механизмов реакций фотосинтеза и их связи с физиологическим состоянием растений.
Замедленная флуоресценция — биофизический метод, несущий информацию о функционировании первичных реакций фотосинтеза в интактных объектах или послесвечения фотосинтезирующих организмов.
Кратко природу возникновения и механизм замедленной флуоресценции у фотосинтезирующих организмов можно представить следующим образом.
Сравнительное изучение спектров излучения быстрой (10-9 с) и замедленной (в мс) флуоресценций показало их сходство. На этом основании был сделан вывод, что ЗФ возникает при излучательной дезактивации первого синглетного возбужденного состояния хлорофилла.
Вместе с тем в отличие от быстрой флуоресценции хлорофилла растений, которая затухает за время порядка 10-8 - 10-9 с, длительность замедленной флуоресценции значительно превышает собственное время синглетного возбужденного состояния хлорофилла. Это показывает, что ЗФ обусловлена вторичным возбуждением хлорофилла при обратных реакциях образовавшихся на свету фотопродуктов.
Кинетика замедленной флуоресценции очень сложна и многокомпонентна. Это обусловлено тем, что стадии стабилизации запасенной энергии света обратимы и могут генерировать возбужденное состояние хлорофилла.
Установлено, что ЗФ зеленых растений возникает в основном в реакционных центрах фотосистемы II и очень слабая ЗФ может наблюдаться в фотосистеме I.
При рекомбинации* возбужденных молекул реакционного центра часть образующейся при этом энергии передается молекулам светособирающего хлорофилла, который излучает ее в виде квантов замедленной флуоресценции.
*Рекомбинация — это обратный процесс ионизации, при котором ионы противоположных знаков, соединяясь, образуют нейтральную молекулу; соединение электрона и ионизированного атома с образованием нейтрального атома.
Необходимо отметить, что интенсивность ЗФ пропорциональ на скорости реакций рекомбинации зарядов в реакционных центрах (РЦ) и концентрации реакционных центров с разделенными зарядами, а также скорости переноса электронов по ЭТЦ, которая изменяется в зависимости от внешних условий. Насыщение ЗФ зависит от интенсивности освещения и количества молекул хлорофилла в фотосинтетической единице, «обслуживающих» реакционный центр.
Явление замедленной флуоресценции наблюдается у всех видов фотосинтезирующих организмов. Наличие флуоресценции тесно связано с функциональной целостностью фотосинтетического аппарата. Этиолированные листья, мутанты растений и водорослей с неактивными фотохимическими реакционными центрами не испускают замедленной флуоресценции.
С помощью метода ЗФ можно получить информацию о состоянии первичных процессов фотосинтеза, а именно: о повреждении акцепторов фотосистемы второй (ФС II) или замедлении транспорта электронов после фотосистемы II; повреждении РЦФС І, принимающего электрон после ФС II, что вызывает замедление затухания ЗФ; повреждении системы разложения воды, что приводит к подавлению долгоживущих компонентов системы с \(\tau \gt 20\, мс\), кроме того, происходит исчезновение осцилляций кислородвыделяющей системы.
Таким образом, формы световой зависимости и кривой затухания ЗФ могут характеризовать скорость электронного транспорта в ЭТЦ до и после ФС II; исследование осцилляций ЗФ при освещении серией коротких вспышек является тестом на активность кислородвыделяющей системы и кинетических ее состояний.
Возможности использования метода ЗФ для характеристики фотосинтетического аппарата были испытаны и проверены на различных объектах, что подтвердило целесообразность его применения в прикладных исследованиях.
Метод ЗФ характеризуется высокой чувствительностью, надежностью, экспрессностыо и возможностью автоматизации получаемой информации интактных объектов в полевых условиях.
В заключение следует сказать, что метод замедленной флуоресценции имеет большие потенциальные возможности для широкого внедрения в практику исследований по физиологии растений, для оценки гербицидной активности химических соединений, в практической селекции растений, для выявления устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды, исследования температурной адаптации растений, а также в экологии, гидробиологии и океанологии.
Как свидетельствуют Д. Н. Маторин, П. С. Венедиктов, А. Б. Рубин, на кафедре биофизики МГУ разработаны такие конструкции портативных переносных устройств с автономным питанием, которые могут быть использованы в полевых условиях или передвижных лабораториях. Разработанные методы и аппаратура успешно используются в селекционной практике в ряде сельскохозяйственных учреждений нашей страны и за рубежом.