Питание растения азотом

Среди органогенов азот занимает одно из важнейших мест. Значение его в жизни растений чрезвычайно велико. Без азота не могут синтезироваться белковые вещества, а без них не может образоваться и протопласт живой клетки.

Азота в растении меньше, чем углерода, водорода и кислорода, которые составляют до 95% сухого вещества растения. На азот приходится лишь 1-3%, однако без достаточного количества его в почве развитие растений невозможно. Вот почему вопрос об источниках азота для растений представляет большой интерес.

Рис. 55. Метаболизм азота

Низкая урожайность многих сельскохозяйственных культур чаще всего определяется недостатком именно азота. Для формирования урожая зерновых культур 2-3 т с 1 га необходимо, 150-200 кг азота в форме доступных для растений соединений при общем количестве его в почве от 5 до 15 т на 1 га.

В атмосфере количество свободного молекулярного азота достигает 80%. Из соединений азота в атмосфере имеется незначительное количество паров аммиака, выделяющегося вследствие гниения органических остатков, а также окислов азота, образующихся при электрических разрядах во время грозы и выпадающих вместе с осадками. В почве азот содержится в виде органических и минеральных соединений — аммонийных солей и солей азотной кислоты. Органические соединения азота — это преимущественно белковые вещества и продукты их распада — аминокислоты (рис. 55).

В середине XIX в. французским ученым Ж. Буссенго, а затем и другими учеными было установлено, что свободный молекулярный азот недоступен для высших зеленых растений. Его опыты с подсолнечником (в один сосуд с прокаленным песком вносили азот, а в другой — нет) показали, что молекулярный азот для высших растений недоступен и без него растение не развивается (рис. 56). Было доказано, что весь необходимый азот растение получает из почвы.

Различают несколько видов соединений азота, а именно: органические соединения — азот органический, соли аммиака — азот аммиачный и соли азотной и азотистой кислот — азот нитратный. Различные формы азота, содержащиеся в почве, — основной источник этого элемента для питания растений.

Рис. 56. Опыт Буссенго с выращиванием подсолнечника в песчаной культуре с селитрой (1) и без нее (2)

Общее количество азота в почве незначительно. Так, в глубоком черноземе Лесостепи УССР содержится азота: общего — 0,3-0,4 %, аммиачного — 0,002-0,004, нитратного — до 0,004%. В подзолистых, каштановых почвах его значительно меньше. Основная масса азота в почве — это органический азот; содержание аммиачного и нитратного азота невелико и на протяжении весеннего, летнего и осеннего сезонов значительно колеблется.

В практике сельскохозяйственного производства в почву обычно вносят навоз и различные компосты. В почве содержатся также органические остатки растений (корни, стебли), которые разлагаются до аммиачных и азотнокислых солей, определенная часть азота в ней сосредоточивается в виде органических соединений. Известно, что органические вещества в почве подвергаются разложению микроорганизмами, образующими различные продукты жизнедеятельности, которые усваиваются корневой системой растений. Поэтому вопрос, усваиваются ли органические формы азота высшими зелеными растениями, можно решить лишь с помощью метода стерильных культур.

Стерильные культуры зеленых растений аналогичны применяющимся в микробиологии. Создают стерильную питательную среду, семена перед проращиванием также стерилизуют антисептиками, которые уничтожают все микроорганизмы, содержащиеся на их поверхности, но не убивают зародыш. Семена, а затем корневую систему растения помещают в среду, лишенную бактерий. Сосуд закрывают стерильной ватной пробкой. Надземная часть растения находится в обычных условиях. Опыты со стерильными культурами показали, что органические азотсодержащие соединения — мочевина H₂N—CO—NH₂ и аспарагин \(\small\ce{CO(NH2)*CH2*CHNH2*COOH}\) легко усваиваются растениями, а аминокислоты — значительно труднее.

Опыты, проведенные Н. Г. Холодным и другими исследователями, показали, что к органическим соединениям, усваиваемым растениями, следует отнести и такие органические вещества почвы, как аминокислоты, органические фосфорсодержащие соединения, антибиотики, гуминовые кислоты, витамины, ауксины и др. Растениями не усваиваются белки, липиды и другие нерастворимые в воде соединения азота, которые входят в состав перегноя.

Из всех соединений, содержащихся в почве, лучшими источниками азота являются аммиачные соли и соли азотной кислоты (неорганические соединения). Азот и углерод, содержащиеся в навозе, органических остатках, могут использоваться растением после того, как под действием бактерий они превратятся в неорганические соединения. Таким образом, существует тесная связь между питанием зеленых растений и деятельностью почвенных микроорганизмов.

Процесс разложения белков, аминокислот, мочевины и других органических азотистых веществ в почве называется аммонификацией, а почвенные организмы, осуществляющие этот процесс, — аммонификаторами. Они обладают активными ферментами, способствующими быстрому разложению белков до аминокислот, которые дезаминируются с образованием NH₃. Часто наблюдается гидролитическое дезаминирование: аминокислоты, присоединяя воду, образуют оксикислоту и аммиак: $$\ce{RCHNH_2COOH + H_2O = RCHOHCOOH + NH_3.}$$

Минерализацию органического азота, начатую аммонификацией, завершает процесс нитрификации, осуществляемый хемосинтезирующими нитрифицирующими бактериями - аэробами Nitrosomonas и Nitrobacter. Нитрификация проходит в две стадии. Сначала нитритные бактерии (Nitrosomonas) окисляют NH₃ до нитрита: $$\ce{NH_4^+ + 1 1/2O_2 \to NO_2^- + 2H^+ + H_2O}.$$

Во второй стадии нитратные бактерии (Nitrobacter) окисляют нитрит до нитрата: $$\ce{NO_2^- + 1/2O_2 \to NO_3^-}.$$

Нитрифицирующие бактерии за счет энергии окисления могут усваивать СО₂ атмосферы или карбонатов и использовать для синтеза органических веществ клетки. Интенсивность нитрификации является показателем плодородия почвы. В кислых и плохоаэрируемых почвах накапливаются аммонийные соли. В нейтральных почвах, имеющих комковатую структуру, где обеспечивается хороший доступ кислорода, преобладают нитраты.

Корневая система растений способна непосредственно поглощать аммонийные и нитратные соли. Д. Н. Прянишников и его сотрудники доказали, что в питании растений аммонийные соли не уступают нитратным. В земледелии широко применяются также высокоэффективные жидкие азотные удобрения: 20-25%-ная аммиачная вода и углеаммиакаты.

Д. Н. Прянишников установил, что одним из важнейших условий использования аммонийных или нитратных солей является реакция среды: в слабокислой среде при pH 5 лучше усваиваются нитраты, и, наоборот, в нейтральной среде при pH 7 лучше поглощаются аммонийные соли. Для использования аммонийных солей необходимо достаточное количество углеводов в растениях, без которых задерживается превращение их в амиды, накапливается аммиак, действующий токсически на растение. При питании растений физиологически нейтральной солью (NH₄NO₃) и реакции среды, близкой к нейтральной, лучше усваивается катион NH₄⁺, чем анион N0₃^-, в этом случае соль будет физиологически кислой.

Таким образом, реакция среды имеет большое значение для усвоения растениями соединений, содержащих азот. Экспериментально доказано, что преимущественное поглощение аммонийных солей свойственно растениям, склонным к усиленному образованию органических кислот.

Превращение азота при синтезе белковых веществ в растении

В растительном организме, согласно теоретическим и экспериментальным данным, процесс восстановления нитратов до аммиака катализируется ферментами флавопротеидами и активизируется металлами. Процесс этот сопровождается изменением состояния атома азота — его валентности. Ниже приводится схема восстановления нитратов в растении: $$\large \ce{\underset{Нитраты\;N^{+5}}{HNO3} ->[нитраредуктаза][Mo] \underset{Нитриты\;N^{+3}}{HNO2} ->[нитраредуктаза][Cu, Fe, Mg] \underset{Гипонитриты\;N^{+1}}{(HNO2)} ->}$$ $$\large \ce{->[гипонитритредуктаза][Cu, Fe, Mg] \underset{Гидроксиламин\;N^{-1}}{NH2OH} ->[гидроксиламинредуктаза][Mn, Mg] \underset{Аммиак\;N^{-3}}{NH3}}.$$

Аммиак, поглощенный растением в виде аммонийных солей или синтезированный в нем в результате восстановления нитратов, вступая в реакцию с кетокислотами, образует аминокислоты. На важность этой реакции указывал еще С. П. Костылев, который писал, что в растении прямое аминирование кетокислот аммиаком — это общий способ первичного построения аминокислот. Действительно, этот путь синтеза аминокислот является основным, и, очевидно, таким путем в растении синтезируются все аминокислоты, например аланин из аммиака, пировиноградной кислоты и водорода под действием соответствующей ферментной системы: $$\ce{NH3 + CH3COCOOH + 2H <--> CH3CHNH2COOH + H2O.}$$

Особенно легко аммиак реагирует с щавелевоуксусной и α-кетоглутаровой кислотами: $$1) \ce{\underset{\text{щавелевоуксусная кислота}}{HOOC * COCH2COOH} + NH3 + 2H <--> \underset{\text{аспарагиновая кислота}}{HOOC * CH2CHNH2} * COOH + H2O}$$ $$2) \ce{\underset{\alpha-кетоглутаровая\; кислота}{HOOC * CH2 * CH2CO * COOH} + NH3 + 2H <-->}$$ $$\ce{<-->\underset{глутаминовая\; кислота}{HOOC * CH2CH2CHNH2 * COOH} + H2O.}$$

Пировиноградная, щавелевоуксусная и α-кетоглутаровая кислоты — важнейшие продукты превращения углеводов в организме растений и животных. Поэтому реакция образования аминокислот прямым аминированием кетокислот аммиаком имеет большое значение как путь, действительно связывающий обмен углеводов с обменом аминокислот и белков. Эта тесная связь определяется еще и тем, что дикарбоновые аминокислоты могут передавать свои аминные группы кетокислотам с помощью ферментативного переаминирования. Реакция переаминирования была открыта в 1937 г. советскими биохимиками А. Е. Браунштейном и М. Г. Крицман. Она заключается в межмолекулярном переносе аминогрупп с аминокислоты на кетокислоту, катализируется ферментами, которые называются аминотрансферазами. Обязательное условие действия аминотрансфераз — участие в реакции аминокислоты (аспарагиновой, глутаминовой и др.) и кетокислот (щавелевоуксусной, α-кетоглутаровой и др.), например: $$\ce{\underset{\text{глутаминовая кислота}}{HOOC * CH2CH2CHNH2COOH} + \underset{\text{щавелеуксусная кислота}}{HOOC * COCH2COOH} <-->}$$ $$\ce{<-->[аминотрансфераза]\underset{\alpha-кетоглутаровая\;кислота}{HOOCCH2 * CH2COCOOH} + \underset{аспарагиновая\;кислота}{HOOC * CH2CHNH2COOH.}}$$

Так же происходит переаминирование глутаминовой и пировиноградной кислот под влиянием аминотрансферазы и образование аланина и α-кетоглутаровой кислоты; аспарагиновая и пировиноградная кислоты образуют аланин и щавелевоуксусную кислоту.

В последнее время формируется представление о механизмах и путях синтеза аминокислот в зеленом листе. Так, считается, что только аланин, валин и ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан) синтезируются изолированными хлоропластами, остальные аминокислоты образуются только после добавления к изолированным хлоропластам митохондрий и пероксисом и что существенный вклад в образование аминокислот на свету вносит фотодыхание.

С помощью ^l5N выявлено, что в хлоропластах ферментная система глутаматсинтетаза — глутаматсинтаза осуществляет основной путь ассимиляции аммиака в растении. Фермент глутаматсинтетаза (из класса лигаз) активизирует реакцию: $$\ce{АТФ + L-глутамат + NH3 = АДФ + ортофосфат + L-глутамин}$$

В результате такого механизма биосинтеза аминокислот определяется важная роль фотосинтеза в процессе синтеза белка в растении (Т. Ф. Андреева).

Особенности азотного питания бобовых растений

На корнях бобовых растений образуются клубеньки, в которых находятся бактерии, способные усваивать азот атмосферы, питаться им и обогащать почву этим элементом. Таким путем, создаются лучшие условия для питания злаковых и других культур, которые высевают после бобовых (рис. 57).

Значение бобовых растений было обнаружено практиками еще задолго до открытия наукой причин, объясняющих это явление.

Памятники древней культуры свидетельствуют о широком использовании бобовых растений в Китае в V в. до н. э. Произведения писателей Древнего Рима Теофраста (III в. до н. э.), Вергилия (I в. до н. э.) также содержат сообщения о пользе бобовых растений. В Древнем Риме широко использовали смесь бобовых культур с другими растениями.

В 1837 г. Ж. Буссенго культивированием клевера и гороха на средах, содержащих мало азота, установил, что бобовые, растения способны усваивать азот атмосферы. Он доказал, что в условиях стерильной почвы они не могут ассимилировать атмосферный азот. Несмотря на результаты таких опытов, этот вопрос все еще оставался нерешенным.

Русский ученый М. С. Воронин в 1865 г. установил, что в клубеньках на корнях бобовых растений (люпина) находятся мельчайшие тельца — бактерии. Роль их была выяснена в 1886 г. немецким ученым Г. Гельригелем, который доказал присущую им способность фиксировать атмосферный азот в клубеньках. В 1888 г. клубеньковые бактерии выделил в чистую культуру голландский исследователь М. Бейеринк и описал их под названием Bacterium radicicola (род Rhizobium). В молодых клубеньках бактерии имеют вид мелких подвижных палочек; в клубеньках более позднего возраста они становятся неподвижными и приобретают ветвистую форму, известную под названием бактероидов. В бактероидах клубеньковых бактерий содержится полимер β-оксимасляная кислота — источник углерода.

На основании морфологических и физиологических различий клубеньковые бактерии подразделяют на две группы. Бактерии первой группы хорошо развиваются на средах с желатином и сахаром и образуют сильно раздутые бактероиды без выростов; бактерии второй группы не развиваются на средах с желатином, их бактероиды палочковидной формы.

Клубеньковые бактерии по специфичности и принадлежности к определенным родам и видам бобовых растений делят на десять видов (по Н. А. Красильникову): 1) бактерии люцерны и донника; 2) бактерии клевера; 3) бактерии гороха, вики, кормовых бобов, чины, нута; 4) бактерии люпина; 5) бактерии фасоли; 6) бактерии арахиса; 7) бактерии эспарцета; 8) бактерии сои; 9) бактерии лоха; 10) бактерии сераделлы.

Финский ученый А. Виртанен в клубеньках бобовых растений открыл три пигмента: красный, коричневый и зеленый. Красный пигмент оказался гемоглобином. Количество красного пигмента в клубеньках зависит от интенсивности света, а также от возраста бобового растения. В ясные солнечные дни клубеньки интенсивно краснеют. Эти пигменты способны к взаимному замещению. Открытие гемоглобина (леггемоглобип) в клубеньках доказывает единство происхождения растительного и животного мира.

Физиологические свойства клубеньковых бактерий представляют большой интерес. Они важны не только для распознавания бактерий, но и для определения их активности в процессах ассимиляции азота атмосферы, необходимого при практическом использовании клубеньковых бактерий в сельском хозяйстве (рис. 58). После того как удалось получить чистую культуру Bacterium radicicola, прошло уже более 90 лет, однако до настоящего времени вопрос о способности этих бактерий усваивать атмосферный азот в чистой культуре окончательно не выяснен.

Рис. 58. Bacterium radicicola в клубеньках бобовых растений: 1 — разрез клубенька люцерны; 2 — клетка клубенька с Bact. radicicola; 3 — бактероиды; 4 — проникновение клубеньковых бактерий в клетки корня через корневой волосок

Установлено, что источником углерода для клубеньковых бактерий являются органические соединения, среди которых важное место занимают углеводы из группы дисахаридов и моносахаридов. Для развития Bacterium radicicola в чистой культуре, кроме углеводов, необходимы зольные элементы и азот в связанной форме. Новейшими исследованиями установлено, что фиксация молекулярного азота является ферментативным процессом.

Из клубеньков сои и люпина получили бесклеточный азотфиксирующий экстракт, содержащий ферментную систему — нитрогеназу, которая была разделена на два компонента: в одном из них содержались железо и молибден, а в другом — только железо. Эти компоненты при объединении их в определенном соотношении катализировали фиксацию молекулярного азота (данные Института физиологии растений АН УССР).

Доказано, что азотфиксирующая активность препаратов фермента заметно повышается при добавлении некоторых веществ — активаторов ферментов, переносчиков водорода, акцепторов продуктов ферментативного синтеза и источников энергии; в качестве таких веществ применяли магний, молибден, биотин, пируват, аскорбиновую кислоту, АТФ. Установлено также, что нитрогеназы активны в анаэробных условиях, а деггемоглобин регулирует снабжение их кислородом.

В растительных клетках внутри клубенька в условиях затрудненного снабжения их кислородом леггемоглобин поддерживает приток кислорода, достаточный для дыхания бактероидов. А активно функционирующая оксидазная система в клетках клубенька обеспечивает достаточное образование АТФ, что позволяет} активно фиксировать азот.

Рис. 59. Соя выросшая на песчаной почве, не зараженной (слева) и зараженной (справа) клубеньковыми бактериями

Клубеньки бобовых растений являются химическими фабриками, в которых процесс фиксации азота в определенные периоды не связан с ростом самих бактерий и с ассимиляцией фиксированного ими азота. Установлено, что до 90% азота, фиксируемого в клубеньках, поступает в растение без включения в состав клеток бактерий или ткани клубеньков. Интенсивность азотфиксации клубеньковыми бактериями определяется фотосинтезом растения и генетическими особенностями бактерий. Связанный в клубеньках азот вступает в обмен веществ; далее,очевидно, осуществляются процессы аминирования и переаминирования, как это происходит с азотом, поступающим из почвы в корневую систему.

Значение клубеньковых бактерий в земледелии огромно. Если в почве содержатся активные специфические формы клубеньковых бактерий, способные вступать во взаимодействие с корневой системой данного бобового растения и ассимилировать атмосферный азот, то в симбиозе с этим видом они ежегодно усваивают свыше 100 кг атмосферного азота на 1 га. По подсчетам Д. Н. Прянишникова, 200 тыс. га клевера или 100 тыс. га люцерны дают за год столько же связанного азота, сколько иной химический комбинат.

Если на поле давно не выращивали бобовые культуры, нужно перед посевом инокулировать их семена соответствующими клубеньковыми бактериями (рис. 59). С этой целью семена слегка увлажняют, смешивают с бактериальным препаратом нитрагином и высевают в почву. Это дает прирост урожая более чем на 20%, способствует значительному накоплению азота в почве (табл. 18).

Однако следует отметить, что не весь азот, который содержится в урожае бобовых трав, взят ими из воздуха: ⅓ его поглощается корнями в виде минеральных солей из почвы. Только при хорошем развитии бобовые могут обогатить почву азотом и улучшить структуру ее за счет очень развитой корневой системы. Поэтому там, где бобовые травы дают низкие урожаи, возделывать их нецелесообразно.

Кроме клубеньковых бактерий, к азотпоглотителям относятся анаэробный микроорганизм Clostridium pasteurianum и аэробный Azotobacter chroococcum. Это свободноживущие в почве бактерии, способные ассимилировать молекулярный азот. Для связывания 20-50 кг азота на 1 га данными бактериями необходимо 1-5 т органического вещества типа углеводов при продуктивирсти азотфиксации 10-20 мг азота на 1 г углеводов. Основным источником органических веществ для этого процесса служат корневые выделения растений, растительные остатки в почве, навоз и зеленое удобрение.

Современные представления о механизме азотфиксации основываются на наиболее распространенной «аммиачной теории». Еще С. Н. Виноградский высказал мысль, что конечным продуктом связывания микроорганизмами молекулярного азота является аммиак. Такую точку зрения разделяют все исследователи. Однако до сих пор еще не выяснены промежуточные этапы превращения молекулярного азота в аммиак.

Считают, что существует два возможных пути превращения азота — восстановительный и окислительный. Доказательством служит тот факт, что при добавлении извне меченного тяжелым азотом гидразина клетки азотфиксаторов используют его. Согласно приведенной схеме (рис. 60), промежуточным продуктом может быть гидроксиламин HONH₂ в незначительных концентрациях, который, вступая в реакцию с различными кетокислотами (пировиноградная, α-кетоглутаровая и др.)

Рис. 60. Гипотетическая схема превращения азота при его биологической фиксации (по В. Л. Кретовичу)

Таким образом, наличие кетокислот — обязательное условие биологической фиксации азота. Участие их в этом процессе тесно связано с действием соответствующих ферментов дегидрогеназ, которые катализируют восстановительное аминирование кетокислот и дезаминирование аминокислот. Так, было доказано, что очень активный фермент глутаматдегидрогеназа азотобактера катализирует синтез глутаминовой кислоты из α-кетоглутаровой кислоты и аммиака по уравнению $$\ce{HOOCCH2CH2COCOOH + NH2 + 2H <--> HOOCCH2CH2CHNH2COOH + H2O}.$$

Дегидрогеназные системы ферментов считают очень активными как для свободноживущих азотфиксаторов, так и для азотфиксаторов-симбионтов. Интересно выяснить роль железосодержащих ферментов при наличии леггемоглобина в клубеньках бобовых растений. Доказано, что борная кислота активизирует усвоение молекулярного азота клубеньковыми бактериями, при этом наблюдается усиление окислительных процессов. Известно также, что для процесса азотфиксации микроорганизмам необходимы железо, молибден и кобальт. Считают, что металлы играют существенную роль в хемосорбции молекулярного азота, а затем и в последующих его превращениях.

Процесс хемосорбции молекулярного азота и его активация, как предполагают, осуществляются в митохондриях с участием окислительно-восстановительной ферментной системы.

В последние годы исследуется и развивается представление о механизме фиксации азота исходя из каталитических свойств фермента нитрогеназы, катализирующего этот процесс. Первичная реакция, в которой фиксируется азот, может быть представлена следующей простой схемой: $$\ce{N2 + 6H+ + 6e^- ->[нитрогеназа] 2NH3}.$$

Установлено, что у различных азотфиксаторов содержится одна и та же ферментная система — нитрогеназа, катализирующая превращение молекулярного азота в аммиак и сопряженную реакцию гидролиза АТФ.

Исследование показало, что нитрогеназа является типичным металлоферментом и содержит железо и молибден (рис. 61). Она состоит из двух белков-олигомеров: Fe-протеина и Mo-Fe-протеина. Для работы нитрогеназы нужны энергия в виде АТФ, поток электронов и водород. Источники энергии и доноры электронов у разных азотфиксаторов различные: у фотосинтетиков — фотосинтез, у анаэробов — брожение, у аэробов — дыхание.

А. Е. Шилов и Г. И. Лихтенштейн предложили четырехэлектронный механизм, где тройная связь \(\ce{N\bond{#}N}\) переходит сразу в одинарную связь производного гидразина \(\ce{(NH2 - NH2)}\). Было установлено, что энергия в очень прочной тройной связи распределена по связям неравномерно. Более половины всей энергии приходится на первую разрываемую связь, а две остальные связи сравнительно слабые. Таким образом, при разрыве сразу двух связей затрачивается меньше энергии, чем при разрыве одной связи.

Гидролиз аденозиитрифосфорной кислоты на границе двух протеинов повышает потенциал восстановителя. Электроны передаются от внешнего восстановителя к биядерному комплексу азота с трехвалентным молибденом, используются протоны воды; в первой стадии синтезируется производное гидразина N₂H₄.

Аммиак, образующийся в результате азотфиксации, усваивается микробной и растительной клетками и служит исходным материалом для синтеза аминокислот и белков. Этот синтез происходит с участием ферментов дегидрогеназ — глутаматде-гидрогеназы, глутаматсинтазы и глутаминсинтетазы. Аммиак является также фактором, регулирующим интенсивность азотфиксации и активность ферментов, катализирующих реакции его усвоения.