Для современной биологии характерно стремление к глубокому проникновению в сущность обмена веществ, дифференциации и специализации клеток, и тканей, саморегуляции, определяющих закономерности роста и развития растительного организма. Для изучения физиологии и биохимии, а также генетики соматических клеток метод культуры изолированных растительных клеток и тканей открывает большие возможности.
Сущность метода культуры растительных клеток и тканей заключается в культивировании на искусственных питательных, средах в строго контролируемых условиях частей растительного организма — от изолированных протопластов до зародышей.
Органы, ткани, суспензии растительных клеток, протопластов культивируют на питательных средах (твердых агаровых или жидких), включающих макро- и микроэлементы минерального питания, сахара (чаще сахароза или глюкоза), витамины, аминокислоты или гидролизат казеина, фитогормоны (цитокинины, ауксины, гиббереллины и биологически активные вещества). Все живые, изолированные клетки и ткани разных органов растений (стебля, корня, листа, стеблевой меристемы, частей цветка покрытосемянных, гаметофитов голосемянных и споровых растений) при определенных условиях культивирования образуют каллусную ткань, состоящую из дедифференцированных клеток. Изменяя условия культивирования каллусной ткани, можно вызвать дифференциацию клеток, образование регенерационных меристем и восстановление целого растения (рис. 70).
Рис. 70. Схема управления регенеративным процессом в изолированных тканях и клетках растений смещением равновесия между нуклеиновым (H) и ауксиновым (A) типами обмена (по Р. Г. Бутенко).
Морфогенез и получение растений из отдельных протопластов, клеток через культуру каллуса — важнейшее звено в исследованиях с культурой растительных клеток и тканей (клеточная селекция, соматическая гибридизация, генная инженерия).
Хотя причины и механизмы дифференциации морфогенеза и регенерации растений в культуре клеток и тканей еще далеко не изучены, установлена ведущая роль в индукции морфогенеза фитогормонов в сочетании с физическими факторами, такими, как температура, свет, аэрация. Таким образом, созданы ряд эмпирических приемов управления морфогенезом в культуре клеток и тканей и возможность их широкого практического применения. При этом соотношение и концентрация цитокининов и ауксинов, а также их искусственных аналогов в таких культурах играют определяющую роль для дальнейшего роста каллусной ткани или морфогенеза и регенерации растения.
Идея выращивания изолированных клеток, тканей и органов вне целого растительного организма была высказана Г. Габерландтом в 1902 г. Однако детальная разработка этого метода была осуществлена Ф. Уайтом (США) и Р. Готре (Франция) в 1932-1934 гг. Координационным центром по культуре растительных клеток и тканей в нашей стране является Институт физиологии растений имени К. А. Тимирязева АН СССР, в котором с 1957 г. начаты систематические исследования в этом направлении.
Исследования по культуре клеток и тканей растений в последние 15-20 лет характеризуются широким спектром направлений, охватывающим культивирование изолированных зародышей и органов, каллусных тканей на агаризованной среде, клеток, небольших клеточных агрегатов, изолированных протопластов в жидкой среде, а также сохранение клеточных линий в условиях глубокого охлаждения. Каждое из этих направлений решает определенные теоретические проблемы, которые находят практическое применение (рис. 71).
Поставлено на промышленную основу получение лекарственных веществ из биомассы культуры ткани женьшеня, идентичных веществам этого растения, произрастающего в природе.
Рис. 71. Схема использования культуры клеток и тканей (по Р. Г. Бутенко).
Методы регенерации растений из меристем уже разработаны для 60 видов и широко используются в практике для массового размножения и оздоровления посадочного материала ряда декоративных растений, а также для оздоровления картофеля от вирусных болезней. Успешно разрабатываются специальные методы создания банка клеток для сохранения генофонда растений путем консервирования в условиях глубокого холода (-196°С) их меристематических тканей, находящихся в точках и зонах роста, и эмбриоидов. Для этого применяют программное замораживание, т. е. постепенное замораживание с точно регулируемой скоростью снижения температуры (порядка 1°С/мин) с использованием специальных веществ — криопротекторов (глицерин, сахара, этиленгликоль и их производные, поливинилпирролидон и диметилсульфоксид), ослабляющих повреждения клеток. Криопротекторы добавляют к среде, в которой находятся клетки перед замораживанием. Банк клеток растений (генофонд) — один из способов сохранения разнообразия растительного мира.
В селекции многих культур открываются перспективы получения ценного исходного материала, включающего генофонд диких сородичей и отдаленных форм. Так, преодоление несовместимости на разных уровнях при скрещивании отдаленных форм обеспечивают оплодотворение в пробирке, культура семяпочек и зародышей, гибридизация соматических клеток. Большой интерес представляют клеточная селекция для создания растений, резистентных к болезням, солям, тяжелым металлам, экстремальным температурам; использование мутагенов на уровне гаплоидных клеток и протопластов, увеличивающее частоту мутаций; возможность получения мутантных клеточных линий растений, продуцентов отдельных веществ. Многообещающим для селекции и генетики стало создание гаплоидных растений из пыльцы и на их основе гомозиготных линий. Гибридизация соматических клеток на основе слияния изолированных протопластов открывает возможности выведения новых форм, которые нельзя получить при гибридизации: гибридов, обладающих гибридной цитоплазмой с геномом одной из родительских форм, так называемых цибридов, межвидовых и межродовых гибридов. Уже получены межвидовые гибриды от слияния изолированных протопластов разных видов моркови, табака, картофеля, петунии, дурмана. В последние годы созданы межродовые гибриды в семействе Пасленовые между картофелем (S. tuberosum) и томатом (L. esculentum) и в семействе Капустные между Arabidopsis thaliana и Brassica campestris (капуста полевая).
Соматическая гибридизация и трансгеноз, т. е. введение в клетку (протопласт) чужеродных информационных макромолекул, в том числе и бактериальных генов, перспективны для создания новых форм растений.
Наиболее широкое практическое применение нашел способ клонового размножения растений, предварительно оздоровленных культурой меристемы стебля. Экономически эффективным он оказался при выращивании многих цветочных, (тюльпан, гвоздика, георгин и т. д.), плодово-ягодных (земляника, малина, вишня, яблоня), технических (хмель, свекла) и других культур. Особое значение этот способ имеет для возделывания важной продовольственной, кормовой и технической культуры — картофеля, сорта которого часто поражаются вирусными болезнями. Доступным и высокоэффективным он стал благодаря научным исследованиям, проведенным в отраслевых институтах картофельного хозяйства нашей страны. Так, на основе общих принципов метода в Украинском НИИ картофельного хозяйства в 1972-1977 гг. была разработана «частная» технология получения и размножения оздоровленного материала картофеля. Она позволила уже в 1979 г. полностью обеспечить потребность первичного семеноводства республики в исходном материале основных районированных и перспективных сортов. В основу оздоровления здесь положено совместное применение культуры меристемы, термотерапии и химиотерапии.
Использование термотерапии, т. е, прогревания прорастающих клубней при 37-38°С, позволило увеличить выделяемую безвирусную меристемную зону с 60-100 до 150-250 мкм, что повысило регенерацию растений из меристем до 60-100%, т. е. в 10 раз и более.
На основе исследований усовершенствована термотерапия: применены термобоксы, увлажняемые субстраты, подкормки макро- и микроэлементами, двухфазное прогревание. В результате выход ростков возрос в 3-14 раз, период прогревания увеличился до 12 нед.
Определяющим фактором успеха культуры меристемы и размножения in vitro картофеля стала питательная среда. Создана среда для быстрой регенерации растений картофеля из черенков и для культивирования меристем (исключение ауксинов, варьирование концентрации сахарозы и смена сред каждые 10 дней), что дало возможность сократить срок регенерации растений из меристем с 6-8 до 1-1,5 мес. При выращивании растений применяют освещение низкой интенсивности — 4-6 тыс. лк (Д. П. Остапенко).
В связи с разработанной технологией оздоровления и выращивания in vitro растений картофеля способ черенкования в пробирочной культуре стал основным при ускоренном размножении сортов. Это позволило размножать материал в любое время года, исключить потери от инфицирования, в течение 6-7 мес оздоровить сорт и получить 40-50 тыс. клубней, что недоступно при использовании других способов ускоренного размножения. В течение года из исходного растения можно получить 4,5×1012 растений картофеля in vitro, пригодных для пересадки в почву и выращивания клубней. Этот способ может оказаться незаменимым при размножении высокоценного сорта.
Высокая экономическая эффективность оздоровления с помощью метода тканевой культуры обусловливается более полной реализацией потенциальной продуктивности картофеля: урожайность возрастает в 1,2-2 раза при улучшении качества клубней.