Вивчали токсичні особливості біопрепаратів та основі природних штампів бульбочкових бактерій бобових культур як екологічно безпечних, ефективних засобів поліпшення азотного живлення і підвищення продуктивності бобових рослин. Доведено, що виробничі штами цих бактерій не патогенні для теплокровних організмів, не здатні викликати інфекційний процес, біопрепарати на їх основі — не токсичні. Обгрунтовані ГДК ризобофіту в повітрі робочої зони при виробництві біопрепарата 1,2•104.
Постановка проблеми. Високий рівень хімічного навантаження, нестача добрив призвели до різкого погіршення родючості грунтів, зниження якості рослинної харчової продукції, що, в свою чергу, створює загрозу здоров’ю і життю населення. Все це вимагає більш повного використання альтернативних засобів покращення грунту і живлення та захисту рослин від хвороб. Серед таких альтернативних засобів найбільш перспективним і ефективним є застосування біологічних препаратів на основі природних штамів азотофіксувальних мікроорганізмів (4, 10, 12).
В процесі еволюції між рослинами і мікроорганізмами склалися певні взаємовідносини. Особливі симбіотичні відносини склалися у рослин з бульбочковими бактеріями.
Бульбочкові бактерії — рухливі аеробні грамнегативні палички, швидкоростучі відносяться до родів Rhizobium і Sinorhizobium, повільноростучі — до Bradyrhizobium. Ці бактерії формують видоспецифічні симбіотичні структури з бобовими рослинами. В бульбочках, що утворюються на коренях бобових рослин, іде активна фіксація молекулярного азоту повітря. На основі нових штамів бульбочкових бактерій різних бобових культур створено високоефективний біопрепарат ризобофіт (4, 11).
Багаторічні токсиколого-гігієнічні дослідження показали, що мікробіологічні препарати не токсичні для людини і навколишнього середовища. В той же час якісна оригінальність таких препаратів, а саме жива природа діючого чинника є причиною обережного ставлення до них з точки зору біобезпеки (1—2, 8—9). Тому при впровадженні мікробіологічних препаратів, як, між іншим, і всіх інших препаратів, обов’язково проводиться їх ретельне токсиколого-гігієнічне дослідження. При цьому досліджуються патогенні властивості як штаму мікроорганізмів, так і товарної форми препарату на його основі.
Мета досліджень та методики їх проведення. Вивчення патогенних властивостей бульбочкових бактерій і ризобофіту проводили згідно діючих методичних вимог з використанням лабораторних тварин (білих мишей, щурів, морських свинок і кролів) (6—7). Досліджували 2 штами бульбочкових бактерій Rhizobium leguminosarum П-2 і Sinorhizobium meliloti 126, що швидко ростуть та 4 штами (Bradyrhizobium japonicum 634б та М-8, Bradyrhizobium sp. (lupines) 1829, Bradyrhizobium sp. (onobruchis) 2921, що ростуть повільно.
Результати досліджень. Результати експериментів свідчать про авірулентність штамів бульбочкових бактерій для теплокровних тварин: лише в одному випадку, при введенні внутрішньочеревинно клітин штаму Rh. leguminosarum П-2, спостерігалась загибель однієї тварини із 10 заражених. Тобто ЛД50 досліджених культур більше від доз, максимально можливих для введення: для білих мишей — >4∙109 КУО/тварину при надходженні через шлунок, >1∙109 КУО/тварину — при внутрішньочеревному введенні і >108 — при інтраназальному; для білих щурів — >1,4∙1010 КУО/тварину при надходженні через шлунок і >5∙109 КУО/тварину — внутрішньочеревинно.
Досліджені мікроорганізми також не токсигенні: введення безклітинного фільтрату культуральної рідини в максимально можливих об’ємах загибелі тварин не викликає i ЛД50 фільтрату > 2,0 мл/тварину.
Здатність бактерій пошкоджувати слизову оболонку вивчали на кролях світлої масті. Досліджували слизову оболонку ока, для чого в кон’юктивальну порожнину вносили по 5∙107 КУО/тварину. Відсутність будь-яких проявів запальних процесів (сльозоточивість, гіперемія, набряк, виділення) свідчить про нездатність бульбочкових бактерій подразнювати слизову оболонку і викликати запалення.
Бактеріологічне дослідження внутрішніх органів показало, що бульбочкові бактерії не проникають в клітини теплокровних тварин і не дисемінують в них, отже, вони і не мають інфективної дії, що підтверджується і відсутністю у дослідних тварин будь-яких клінічних симптомів захворювань.
При дослідженні тварин, заражених Rh. leguminosarum П-2, через шлунок виявляли незначний токсичний ефект за рахунок надходження в організм високих доз біомаси бактерій, що проявлявся лейкопенією переважно за рахунок зниження вмісту лімфоцитів в периферійній крові (табл. 1).
| Показники складу крові | Термін після введення бактерій, доба | Контрольна група | Дослідна група | t | P | ||
| M | m | M | m | ||||
| Гемоглобін, ммоль/л | 1 | 10,46 | 0,29 | 10,12 | 0,58 | 0,52 | >0,5 |
| 3 | 9,90 | 0,47 | 9,09 | 0,37 | 1,35 | >0,1 | |
| 14 | 9,05 | 0,55 | 8,88 | 0,70 | 0,19 | >0,5 | |
| Еритроцити, Т/л | 1 | 8,83 | 0,26 | 8,63 | 0,59 | 0,31 | >0,5 |
| 3 | 8,60 | 0,38 | 7,65 | 0,33 | 1,89 | >0,05 | |
| 14 | 9,25 | 0,47 | 8,74 | 0,47 | 0,77 | >0,25 | |
| Лейкоцити, Г/л | 1 | 8,38 | 0,93 | 5,54 | 0,69 | 2,45 | <0,05 |
| 3 | 9,74 | 1,0 | 7,14 | 0,44 | 2,38 | <0,05 | |
| Паличкоядерні нейтрофілоцити, % | 1 | 0,00 | 0,00 | 0,17 | 0,17 | 1,00 | >0,25 |
| 3 | 0,00 | 0,00 | 0,33 | 0,21 | 1,57 | >0,10 | |
| 14 | 0,17 | 0,17 | 0,50 | 0,34 | 0,87 | >0,25 | |
| Сегментоядерні нейтрофілоцити, % | 1 | 21,50 | 1,61 | 19,50 | 1,75 | 0,84 | >0,25 |
| 3 | 16,00 | 1,41 | 17,00 | 1,98 | 0,41 | >0,50 | |
| 14 | 15,00 | 1,81 | 22,33 | 1,36 | 3,24 | <0,01 | |
| Еозинофіли, % | 1 | 2,33 | 0,61 | 1,17 | 0,17 | 1,83 | >0,05 |
| 3 | 2,67 | 0,80 | 2,67 | 0,33 | 0,00 | >0,50 | |
| 14 | 2,50 | 0,43 | 1,83 | 0,31 | 1,26 | >0,10 | |
| Моноцити, % | 1 | 1,67 | 0,33 | 5,17 | 0,48 | 6,01 | <0,001 |
| 3 | 6,00 | 0,82 | 6,00 | 0,77 | 0,00 | >0,5 | |
| 14 | 4,33 | 0,21 | 5,67 | 0,71 | 1,81 | >0,05 | |
| Базофіли, % | 1 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | >0,5 |
| 3 | 0,17 | 0,17 | 0,17 | 0,17 | 0,00 | >0,5 | |
| 14 | 0,17 | 0,17 | 0,00 | 0,00 | 1,00 | >0,25 | |
| Лімфоцити, % | 1 | 74,50 | 2,06 | 74,00 | 1,83 | 0,18 | >0,5 |
| 3 | 75,17 | 1,14 | 73,83 | 1,51 | 0,71 | >0,25 | |
| 14 | 77,83 | 1,67 | 69,67 | 2,23 | 2,95 | <0,02 | |
| Показник | Дослідна група тварин | Контрольна група тварин |
| Кількість фагоцентів: % | 60,83 ± 4,31 | 63,16 ± 3,68 |
| Кількість фагоцентів: г/л | 2,22 ± 0,30 | 1,81 ± 0,53 |
| Фагоцитарний індекс | 1,80 ± 0,21 | 2,23 ± 0,18 |
| Показник перетравлення, % | 47,93 ± 3,31* | 37,95 ± 2,81 |
| Титр антитіл (lg) на 5 добу після імунізації еритроцитами барана | 4,0 ± 0,35 | 3,66 ± 0,18 |
| Рівень гіперчутливості сповільненого типу на дінітрохлорбензол | 0,85 ± 0,05 | 0,80 ± 0,04 |
| * — різниця вірогідна з р < 0,05 | ||
Результати вивчення дії бульбочкових бактерій на нормальну мікрофлору організму при введенні через шлунок свідчать про відсутність змін в кількісному і якісному складі мікрофлори кишечника навіть при наймасованішому введенні бульбочкових бактерій, які не здатні виживати при надто високій для них температурі тіла теплокровних тварин.
Морфологічні дослідження внутрішніх органів, що не виявили змін, також підтверджують положення про те, що навіть в максимальних дозах бульбочкові бактерії не викликають інфекційної і загальнотоксичної дії на організм.
З метою розробки гігієнічних регламентів мікробного препарату на основі бульбочкових бактерій — ризобофіту — відповідно до чинних методичних вимог (7), піддослідних тварин — білих щурів та морських свинок піддавали інгаляційному впливу аерозолю бульбочкових бактерій. Враховуючи близькість штамів цих бактерій за морфолого-культуральними і патогенними властивостями вивчення тривалої дії ризобофіту проводили на прикладі штаму Rh. leguminosarum П-2 як одного із вивчених продуцентів, при введенні якого тваринам спостерігалась загибель однієї з 10 заражених тварин.
| Термін, доба | Групи мікроорганізмів | Кількість мікроорганізмів в 1 г фекалій, lg КУО/г | |
| Контрольна група | Дослідна група | ||
| Фонові дані | БГКП лактозопозитивні | 7,45±0,13 | 7,33±0,15 |
| БГКП лактозонегативні | 6,25±0,19 | 6,41±0,11 | |
| Лактобактерії | 9,28±0,07 | 9,10±0,08 | |
| Ентерококи | 3,91±0,18 | 3,91±0,18 | |
| Стафілококи | 5,42±0,09 | 5,39±0,09 | |
| Дріжджоподібні гриби роду Candida | 6,20±0,12 | 6,32±0,07 | |
| 14 | БГКП лактозопозитивні | 7,17±0,12 | 6,91±0,10 |
| БГКП лактозонегативні | 6,16±0,15 | 6,32±0,22 | |
| Лактобактерії | 9,42±0,07 | 9,51±0,08 | |
| Ентерококи | 4,64±0,09 | 4,41±0,15 | |
| Стафілококи | 5,64±0,05 | 5,41±0,07* | |
| Дріжджоподібні гриби роду Candida | 6,27±0,09 | 6,47±0,07 | |
| 30 | БГКП лактозопозитивні | 6,75±0,13 | 6,45±0,11 |
| БГКП лактозонегативні | 5,69±0,15 | 5,96±0,23 | |
| Лактобактерії | 9,39±0,09 | 9,45±0,09 | |
| Ентерококи | 5,28±0,17 | 4,56±0,21* | |
| Стафілококи | 5,89±0,16 | 5,49±0,13 | |
| Дріжджоподібні гриби роду Candida | 6,54±0,15 | 6,21±0,23 | |
| 60 | БГКП лактозопозитивні | 6,75±0,07 | 6,37±0,21 |
| БГКП лактозонегативні | 5,69±0,13 | 5,54±0,17 | |
| Лактобактерії | 9,15±0,11 | 8,95±0,12 | |
| Ентерококи | 4,91±0,09 | 4,49±0,13* | |
| Стафілококи | 5,87±0,13 | 5,58±0,09 | |
| Дріжджоподібні гриби роду Candida | 5,50±0,08 | 6,11±0,15* | |
| * — різниця вірогідна з р < 0,05 | |||
З метою розробки гігієнічного регламенту ризобофіту в повітрі робочої зони піддослідних тварин — білих щурів та морських свинок піддавали інгаляційному впливу аерозолю ризобій в інгаляційних камерах з проточним впродовж 1 місяця по 4 години на добу за виключенням вихідних днів. Враховуючи, що граничний вміст непатогенних організмів з санітарно-гігієнічних міркувань не повинен перевищувати 5∙104 КУО/м3 (5, 7), при проведенні токсиколого-гігієнічних досліджень використовували концентрацію продуценту на рівні 1,2∙105±0,27∙105 КУО/м³ . В динаміці проводили фізіологічні, гематологічні, алергологічні, імунологічні, морфологічні та мікробіологічні дослідження.
Встановлено, що піддослідні тварини за своєю поведінкою, зовнішнім виглядом та масою тіла не відрізнялись від контрольних, проведені гематологічні дослідження також не виявили вірогідної різниці морфологічного складу периферійної крові у дослідних і контрольних тварин. Не було виявлено і специфічної сенсибілізації у тварин до досліджуваних мікроорганізмів (табл. 2).
Результати досліджень імуномодулюючої дії бульбочкових бактерій свідчать про відсутність істотних змін у тварин, що підлягали інгаляційній дії цих бактерій, але дещо підвищувався показник перетравлення фагоцитів (табл. 2).
Відомо, яку важливу роль відіграє нормальна мікрофлора організму в його життєдіяльності. Під впливом будь-яких факторів (хімічних, фізичних, мікробіологічного навантаження та ін.) притаманна організму нормальна мікрофлора, як чутливий барометр, може змінюватись.
Експериментальні дані по вивченню мікрофлори тварин, що підлягали дії бульбочкових бактерій, свідчать про незначні відмінності в кількісному складі мікроорганізмів: зменшення кількості стафілококів на 14-й день від початку інгаляції, зменшення кількості ентерококів при дослідженні в кінці інгаляційного терміну і через місяць після його закінчення (період відновлення) (табл. 3). Хоча кількість цих мікроорганізмів знаходилась у межах фізіологічних коливань та і зменшення їх не є негативним моментом, але привертає увагу збільшення у дослідних тварин в кінці відновного періоду кількості дріжджоподібних грибів роду Candida. Тому концентрацію 1,2∙105 КУО/м³ слід вважати порогом хронічної інгаляційної дії за дисбіотичним ефектом.
Враховуючи авірулентність, нетоксичність і нездатність всіх штамів бульбочкових бактерій викликати запальний та інфекційний процес в організмі і беручи до уваги коефіцієнт запасу 10, концентрація ризобофіту, на порядок нижча 1,2∙104 за діючим чинником була рекомендована як ГДК ризобофіту в повітрі робочої зони при виробництві біопрепарату.
Метод визначення ризобофіту в повітрі грунтується на виділенні бактерій Rhizobium і Bradyrhizobium з повітря виробничих приміщень.
Беручи до уваги, що бульбочкові бактерії не патогенні для теплокровних організмів, не здатні нормально розмножуватись у клітинах теплокровних, де температура тіла (38—40°С) не відповідає температурному інтервалу росту ризобій (6—36°С), а тим паче, оптимуму росту (20—28°С) (3—4), а тому не здатні викликати інфекційний процес, а також враховуючи досвід застосування таких бактерій впродовж десятиріч і відсутність випадків захворювань людини чи тварин і високу економічну ефективність вважаємо за доцільне сприяти широкому застосуванню біопрепарату ризобофіту на основі штамів бульбочкових бактерій родів Rhizobium, Sinorhizobium і Bradyrhizobium. Тим більше, що вони екологічно-безпечні, бо є природними мешканцями грунту і не призводять до погіршення санітарно-епідемічного стану грунту та води.
- Виробничі штами бульбочкових бактерій родів Rhizobium і Bradyrhizobium не вірулентні для теплокровних організмів: ЛД50 їх більше 109 КУО/тварину при різних способах надходження в організм.
- 2. Бактерії родів Rhizobium і Bradyrhizobium не викликають подразнення і запалення слизових оболонок теплокровних тварин.
- 3. Бактерії родів Rhizobium і Bradyrhizobium не проникають в клітини внутрішніх органів тварин, не здатні в них розмножуватись і викликати інфекційний процес.
- Фізіолого-культуральні властивості бактерій родів Rhizobium і Bradyrhizobium (температурний оптимум росту 20—28°С, відсутність екзотоксинів) не дають їм можливості розмножуватись в теплокровних організмах до критичної маси, що здатна викликати інфекційний процес.
- Обгрунтована величина ГДК препарату ризобофіт на основі бульбочкових бактерій в повітрі робочої зони на рівні 1,2 ∙ 104 КУО/тварину за дісбіотичною дією.
- Висновки
- Джиндоян Л. С., Найденов А. Я. Принципы обоснования биологической безопасности при работе с патогенными микроорганизмами // Гигиена и санитария. — 1992. — № 5 — 6. — С. 57 — 59.
- Иванова И. А., Устиненко А. Н., Баке М. Я. и др. Влияние некоторых биологических препаратов на организм при однократном и хроническом поступлении // Гигиенические аспекты изучения биологического загрязнения объектов окружающей среды. — М., 1988. — Ч. 2 — С. 21 — 23.
- Катанская Г. А. Превращение азотсодержащих веществ под воздействием микроорганизмов // Большой практикум по микробиологии / Под. ред. Г. Л. Селибера. — М.: Высшая школа, 1962. — С. 165 — 203.
- Коць С. Я., Маліченко С. М., Кругова О. Д., та інші. Фізіолого-біохімічні особливості живлення рослин біологічним азотом. — К.: Логос, 2001. — 271 с.
- Кузьмінський С. М., Мурза В. І. Токсиколого-гігієнічна оцінка мікроорганізмів, перспективних для створення засобів інтенсифікації землеробства // Мікробіол. журн. — 1998. — Т. 60. — № 1. — С. 55 — 63.
- Методические указания по гигиенической оценке микробных средств защиты растений от насекомых и болезней на основе неспорообразующих микроорганизмов. — К., 1982. — 23 с.
- Методические указания по экспериментальному обоснованию ПДК микроорганизмов-продуцентов и содержащих их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды. — М., 1991. — 22 с.
- Омельянець Т. Г. Еколого-гігієнічні аспекти виробництва і застосування в сільському господарстві мікробіологічних препаратів // Мікробіол. журн. — 1994. — Т. 56. — № 1. — С. 37 — 40.
- Омельянець Т. Г. Проблема безопасности микробиопрепаратов, предлагаемых для использования в сельском хозяйстве // Environmental occupational health and safety in agriculture on the boundary of two millennia (Int. Сongr., Kiev, Ukraine, 1998). — К., 1998. — С. 45 — 46.
- Патика В. П., Тихонович І. А., Філіп,єв І. Д., та інші. Мікроорганізми і альтернативне землеробство / За ред. В. П. Патики. — К.: Урожай, 1993. — 176 с.
- Толкачов М. З. Ефективне використання симбіотичної азотофіксації в сучасному землеробстві України — проблеми і перспективи // Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та азотний метаболізм. — Тернопіль, 2001. — С. 142 — 146.
- Шерстобоева Е. В., Дудинова И. А., Крамаренко С. Н., и др. Биопрепараты азотфиксирующих бактерий: проблемы и перспективы применения // Мікробіол. журн. — 1997. — Т. 59. № 4. — С. 110 — 116.
- БІБЛІОГРАФІЯ