Урожаи узколистного люпина в Австралии постепенно увеличиваются, но возделываемые сорта восприимчивы к вирусным болезням, в основном BYMV и CMV, а также к ряду грибковых патогенов. Площади посева белого люпина драматически уменьшаются в связи с недавней вспышкой заболевания антракнозом. Напротив, отбор низкоалкалоидных линий желтого люпина, устойчивых к CMV и главным грибным болезням, привели к резкому увеличению посевов желтого люпина на кислых почвах в Западной Австралии.
Несмотря на некоторые успехи в возделывании видов люпина в целом люпин остается слаборазвитой (under-developed) культурой и методы биотехнологии и молекулярной биологии помогут ускорить процесс улучшения люпина, включая генерирование и размножение трансгенных растений, толерантных к гербицидам и устойчивых к болезням и вредителям . Целый ряд случаев органогенеза и регенерации растений описаны для многих видов люпина. Пионерские работы Lee показали, что экспланты из зрелых зародышей L.hartwegii могут индуцировать каллюсы или регенерировать растения с корнями. Затем каллюсные культуры были получены у L. angus-tifolius, L. albus, L. luteus, L.polyphyllus из эмбриогенных зрелых вегетативных и семядольных тканей.
Высокая частота индукции размножения побегов наблюдалась для каллюсов из эмбриональных верхушек и гипокотилей для всех видов люпина, кроме люпина белого и люпина желтого — у последних наблюдалась низкая частота образования каллюсов из листьев и семядолей и совсем не образовывлись из корней. 96% побегов образовали в культуре корни и 33—35% — жизнеспособные растения. В недавних исследованиях Daza & Chamber осуществили регенерацию жизнеспособных растений желтого люпина из побегов, происходящих из эксплантов гипокотилей, a Rahim & Caligari (1998) описали успешную регенерацию побегов in vitro L.mutabilis, основанную на экс-планте из прорастающих семян.
Две австралийские группыописали опосредованную агробактерией трансформацию и регенерацию люпина узколистного. Были использованы срезы семядольных узлов молодых проростков или развивающихся эмбриональных верхушек, при этом частота трансформации и регенерации была крайне низкой — менее 0,01% для сорта Warrah узколистного люпина. Pigeaire et al. использовали экспланты из прорастающих семян и передачу генов при последовательном развитии побегов из трасформированных верхушечных почек. Частота восстановленных трансгенных растений колебалась от 1,5 до 6%. Этот метод получил широкое распространение в генетической инженерии линий люпина с новыми признаками, включая устойчивость к вирусам. Детали метода описаны ниже.
Предварительный скрининг сортов люпина и штаммов агробактерии
Для транзиентной экспрессии GUS в 19 различных сортах люпина использовали 4 различных штамма A.tumifaciens — AgLO, LBA4404, К61, ЕНА101, каждый из которых нес бинарный вектор, содержащий конструкцию Gus-CaMV355 (pCGP83). Штамм Ag10 обеспечивал самую высокую экспрессию при инфицировании сортов узколистного люпина Unicrop, Merrit и продвинутых селекционных линий, и других видов люпина. Для осуществления трансформации были использованы генные конструкции pCGP963 или pCGP1258 в агробактериальном штамме Ag10. Плазмида pCGP963 происходила от pGA492 и содержала ген bar, контролируемый промотором CaMV-355 и терминатором OCS (синтез октопина). Плазмида pCGP1258 такая же, как pCGP963, за исключением того, что она содержит ген gus из pKIWI101 под контролем промотора 35S.
Экспланты и инокуляция
Эксплант для трансформации представляет верхушку побега оси зародыша, выделенной из прорастающего семени. Для приготовления эксплантов семена со стерилизованной поверхностью проращивают, начиная с вечера, при температуре 25 С или до длины корней 2—10 мм. Кожуру семени, семядоли и две пары листьев помещали под микроскоп для препарирования почечки с апикальным куполом и третьей пары листьев примордия. Для облегчения агробактериальной инфекции апикальный купол протыкали иглой 30G перед постановкой вертикально (т. е. с корнями в твердую среду) на ко-культивируемую среду, содержащую МС соль с витаминами В5, 10 мг БАП и 1 мг НУК, отрегулированную до рН = 5,8. Впоследствии было найдено, что добавление глюкозы (10 цМ) и ацетосирингона (20 цМ) (acetosyringone) к среде повышает частоту трансформации.
Каплю (5 µl) агробактериальной культуры с содержанием в МС соли 5×108 клеток/мл наносили на верхушку раненого апекса. Экспланты ко-культивировали с бактериями в течение 2 дней при слабой освещенности при 25°С, после чего их перенесли на регенерацион-ную среду (МС среда, дополненная 1/10 регуляторов роста и 15 мг 1-1 тиментина для ингибирования роста агробактерии). Трансформированные клетки были отобраны при применении раствора, содержащего 2 мг/мл гербицида глуфозината и 0,1% твин-20 на апекс. Экспланты выращивали на такой среде при слабом свете при 25°С с 8-часовым фотопериодом.
Отбор и регенерация трансгенных пазушных побегов
Почти 100% эксплантов, ко-культивированных с pCGP963/Ag10 или с pCGP1258/Ag10, регенерировали побеги (10—15 мм длиной), но регенерация не происходила в случаях, когда экспланты ко-культивировали со штаммом Ag10 без гена bar. Две недели спустя пазушные побеги были перенесены и помещены на «микроразмножающуюся» агаризированную среду (0,9% агара, 1/10 регуляторов роста, 150 мг тиментина, 20 мг/л глуфозината), которая способствовала развитию трансформированных пазушных почек.
Зеленые побеги переносили на свежую среду каждые две недели, где они начинали образовывать пазушные побеги. В отличие от контрольных побегов, которые обычно образуют пазушные побеги на четырех сторонах (при выращивании на среде без глуфозината) трансформированные побеги часто образуют вторичные побеги только на одной стороне. Это указывает на химерную природу первичных трансформантов, требующих повторного отбора.
Вторичные побеги переносили и культивировали в присутствии глуфозината, которые в свою очередь продуцировали пазушные побеги на двух сторонах: их снова переносили и культивировали. Во многих случаях первичные и вторичные побеги не выживали при отборе в течение трех месяцев, а оставались только третичные и четвертичные побеги, которые переносили в теплицу.
Прививка трансгенных побегов
В предварительных экспериментах трансформированные побеги люпина не формировали корней даже при изменении уровня гормонов, стимулирующих корнеобразование. В связи с этим проводили прививку трансформированных побегов. Для этого несколько трансгенных побегов (клонов) были привиты на семядольный узел 10—14-дневных проростков соответствующего им сорта, выращиваемых в песке на полном питательном растворе (Hoagland — раствор с 5 µM KNO3) Ткань выше семядольного узла удаляли и оставшийся кусочек стебля 5 мм длиной расщепляли вдоль так, чтобы маленький побег из культуры мог быть вставлен и надежно держался.
Прививки с их корневыми подвоями накрывали пластиковыми колпачками и обвязывали алюминиевой фольгой на 3—4 дня, после чего фольгу удаляли. После этого появлялись новые ткани на привитых побегах. Затем через 1—2 дня удаляли колпачки и в дальнейшем растения выращивали в нормальных условиях теплицы для получения жизнеспособных семян. Период времени, в течение которого выращивают трансгенные побеги, зависит от времени цветения. Если побеги находились в культуре тканей продолжительный период (более 4 месяцев) перед прививкой, они зацветали слишком рано и не завязывали семян.
Для нормального завязывания семян удаляют цветочные почки с главной верхушки, оставляя для цветения пазушные побеги в момент хорошего развития вегетативной части прививочного побега.
Развитие корней на побегах люпина
Для индуцирования образования корней основание побега в 1мг/мл-1 помещали в индолилмасляную кислоту (ИМК) и затем побеги выращивали на среде для микроразмножения, содержащей 3 мг ИМК 1-1 без других гормонов. Корни образовывались примерно через 2 недели в культуре, затем спустя 3 недели проростки переносили в теплицу.
Испытание на генетическую трансформацию
Трансформированные пазушные побеги, развившиеся на среде с глуфосинатом (20 мг/мл-1, были толерантны к раствору глуфосината 2 мг/мл-1 (в 0,1% твин-20). Привитые побеги и листья, экспрессирующие ген bar, в последующих поколениях были толерантны к глуфосинату 0,1 мг/мл-1 при испытании на окрашенных листьях и в целом на растениях (BASTA = глуфосинат 0,1 мг/мл-1). Устойчивость листочков или целых растений оценивали спустя 6—14 дней. Стабильность интеграции гена bar также была подтверждена Southern-анализом геномной ДНК и Northern-анализом РНК, изолированных из листовой ткани.
Частота трансформации и время, требуемое для реализации нового генотипа
Завершающая частота трансформации у современного коммерческого сорта узколистного люпина Merrit в первых экспериментах была около 0,4%, но она значительно варьировала среди других сортов люпина. Например, для старого, одного из первых сортов узколистного люпина с нерастрескивающимися бобами частота трансформации составила 2,8%. Для подтверждения инициальной трансформации требуется период около 5 месяцев, в конце которого получают серию трансформированных побегов для прививки. Поколение семян Т1 получают в последующие 5 месяцев, а достаточное для полевого и вегетационного испытания семян — в поколении ТЗ. Таким образом, от инициальных эксплантов до контрольных полевых опытов в трех местах требуется более трех лет. Фактически, от начала трансформации до внедрения в фермерское хозяйство нового трансгенного сорта люпина требуется 6 лет. По сравнению с более ранними работами с геном bar системы трансформации и регенерации были усовершенствованы и частота трансгенеза была доведена до 2,5% для сорта Merrit и 6% для сорта Unicrop.
Пока нет публикаций по получению стабильной, практически значимой трансформации у других видов люпина, но успешные исследования ведутся с видами L.luteus, L.albus, L.polyphyllus с использованием в качестве векторов плазмид A.tumifaciens и A.rhisogenes.
Размножение трансгенных растений
Стандартная процедура размножения трансгенных растений узколистного люпина следующая:
- поверхностная стерилизация семян (2 мин. 70% этанол, 10% NaCl, с 0,1% твин-20, 3-минутное промывание в стерильной дистиллированной воде);
- проращивание на стерильной влажной фильтровальной бумаге в течение 24 часов;
- удаление кожуры семени точно ниже первичного корешка / гипокотиля;
- инокуляция меристемы A. tumifaciens (10—15 укалываний стерильной 30G гиподермической иглой);
- ко-культивация (4 дня с A.t.) меристемы в твердой регенерационной среде — модифицированная MS-основная среда (Murashige & Skoog, 1962) с добавлением 1 мг/мл витамина В5, 5 мг/мл ВАР, 1 мг/мл NAA, 30 г/мл сахарозы и для затвердения 0,25% гельрита (рН 5,8);
- добавление в регенерационную среду 1 мг/л ВАР, 1 мг/л NAA, 20 мг/л глуфозината и 150 мг/л тиментина (Timentin) для удаления A.t.;
- увлажнение меристемы 2 г/л глуфозината;
- после 2—3 недель культивирования — пересадка на среду микроразмножения — MS-среда, 0,1 мг/л ВАР, 0,001 мг/л NAA, 150 мг/л тиментина, 20 мг/л глуфозината, 1 мг/л смеси витамина В5 и 0,9 г/л бактоагара (раствор с рН 5,8);
- субкультура зеленых побегов, при этом каждые 2 недели удаляются мертвые ткани;
- размножение трансгенных побегов.
Этот метод трансформации с использованием в качестве вектора A.t. применен как для получения трансгенных растений, устойчивых к гербицидам, так и растений, устойчивых к болезням.
Процедура генерации трансгенных растений желтого люпина почти аналогична вышеизложенной, но более трудная. Если при обработке IBA у люпина узколистного образуется 30—50% побегов, то у люпина желтого только 10%.
Трансформация по приданию люпину вирусоустойчивости
Узколистный люпин в условиях Западной Австралии восприимчив к двум главным вирусным болезням — вирусу огуречной мозаики (CMV или BOM) и вирусу желтой мозаики фасоли (BYMV или ВЖМФ). ВЖМФ является основным патогеном ряда видов люпина, в т. ч. трех возделываемых. Желтый и белый люпин имеют гермплазму устойчивости к ВОМ. Трансгенная технология используется для интродукции инженерной устойчивости к ВЖМФ узколистному и желтому люпину, а устойчивости к ВОМ — узколистному люпину.
У желтого люпина идентифицирован доминантный ген сверхчувствительной устойчивости к ВОМ — Ncm-1 и достигнут прогресс в выявлении молекулярного маркера и изоляции этого гена. Подход для получения инженерной устойчивости к ВЖМФ и ВОМ заключается в создании генных конструкций, происходящих от геномов ВЖМФ и ВОМ, которые экспрессированы на тРНК или белковом уровне растения-хозяина. Трансгенные растения желтого люпина, содержащие полную длину Ncm-1а (ядерное включение гена) из ВЖМФ, показали повышенную устойчивость к вирусу. Аналогичный подход был успешным в интродукции узколистному люпину устойчивости к ВОМ (16).
Серия трансгенных растений желтого люпина была продуцирована при использовании агробактериального вектора. Растения поколения Т6, содержащие 35S-bar селективный ген, контролирующий устойчивость к гербициду BASTA, содержали антивирусную конструкцию, основанную на различных генах ВЖМФ. Скрининг трансгенных растений в условиях поля, теплицы и лаборатории показал, что трансгенные растения обладают устойчивостью к ВЖМФ и толерантностью к гербициду.
Полученные трансгенные растения желтого люпина анализировали с помощью молекулярных маркеров для демонстрации стабильности интеграции чужеродного гена в растительный геном и экспрессии гена bar. Опыты в теплице показали, что трансген активен и стабильно наследуется. При ручной инокуляции, а также с помощью тли ВЖМФ были выявлены две трансгенные линии с существенной устойчивостью к вирусу.
ВОМ является главным патогеном узколистного люпина и передается семенами и тлей. Но гены устойчивости к ВОМ имеются у других видов люпина (люпины желтый и белый). Поэтому исследовательские программы используют молекулярные подходы к инженерной устойчивости к ВОМ. Ранее авторами был разработан RT-PCR тест для определения присутствия ВОМ в семенах, который использовался в течение 5 лет в фермерских хозяйствах. Этот тест позволил разделить вирус на субгруппы I и II.
Инженерная устойчивость к грибным болезням
Работа по приданию люпину инженерной устойчивости к грибным болезням менее успешна, чем к вирусам. Люпин атакуют несколько видов некротрофных грибных патогенов: плейохета, фомопсис, антракноз, ризоктония. В целом, устойчивость к этим патогенам, вероятно, полигенна. Поэтому, для инженерной устойчивости потребуется серия генов, каждый из которых определяет некоторую долю устойчивости, при этом для генерирования эффективной устойчивости требуется их аддитивное действие. Пока получены инициальные, но обнадеживающие результаты.
Молекулярная диагностика
Имеются определенные успехи в развитии молекулярной диагностики зараженности семян люпина ВОМ и инфекции антракноза. Тесты для обоих патогенов узколистного люпина были разработаны и внедрены в производство в Австралии. RT-PCR тест для оценки ВОМ позволяет обнаружить 1 инфицированное семя в образце из 1000 семян и может быть использован для идентификации субгрупп вируса. Если вирус в образце не обнаружен, дальнейшие тесты не проводят, а если вирусная инфекция найдена, то 10 образцов по 100 семян экстрагируются и подвергаются ELISA — оценке. Семена узколистного люпина признаются кондиционными для посева, если уровень вирусной инфекции составляет не более 0,5%. Недавно RT-PCR тест был конвертирован в тест флуоресцентной PCR с количественным использованием „Taqman 7700 detection (Perkin Elmer)“. При использовании дополнительного праймера, локализованного между двумя определенными праймерами с флуоресцентной меткой в одном конце и ее отсутствием в другой, флуоресценция сДНК от ВОМ в каждом образце PCR может быть измерена, так что уровень ВОМ будет определен количественно в каждом образце.
Для выявления инфекции антракноза районы рДНК (рибосомальная ДНК) из серии грибов, включая антракноз люпина, антракноз из других видов и ряд других грибных патогенов и сапрофитов клонировали и се-квенировали. Выверка этих секвентов показала, что антракноз люпина вызывает скорее гриб C.aculatum, чем C.gleoesporioides. PCR-оценка позволяет находить 1 инфицированное семя люпина из 10 тыс. семян и широко применять ее в производстве.