Исследовано влияние недостаточного увлажнения (НУ) и препаратов, относящихся к различным классам химических соединений: фосфорорганического соединения – мелафена (меламиновая соль бис (оксиметил)-фосфиновой кислоты, амбиола (2-метил-4-диметиламинометил-бензилимидазол-5-ол-дигидрохлорида) и герматрана (1-(герматран-1-ил)-1 оксиэтиламина) на жирнокислотный состав мембран и энергетику митохондрий 6-дневных этиолированных проростков гороха (Pisum sativum L.). Показано, что недостаточное увлажнение приводило к изменениям в жирнокислотном (ЖК) составе мембран митохондрий. Коэффициент ненасыщенности ЖК, содержащих 18 и 20 атомов углерода атомов углерода, снижался в 1,5 и 3 раза соответственно. Изменение жирнокислотного состава мембран митохондрий сопровождалось изменениями максимальных скоростей окисления НАДН-зависимых субстратов и скоростей транспорта электронов на терминальном участке дыхательной цепи. Замачивание семян в 2×10-12 М растворе мелафена или 2×10-5 М растворе герматрана предотвращало изменения биоэнергетических характеристик митохондрий проростков гороха в условиях дефицита воды. Обработка семян гороха 10-9 М амбиолом почти не оказывала защитного действия на биоэнергетические характеристики митохондрий проростков гороха. Предполагается, что различный характер влияния биологически активных соединений на функциональное состояние митохондрий обусловлен различием во влиянии исследуемых БАВ на ЖК состав мембран этих органелл.
Ключевые слова: Pisum sativum, митохондрии, дефицит воды, пероксидное окисление липидов, активные формы кислорода, жирнокислотный состав мембран
Недостаток воды нарушает нормальную жизнедеятельность растений. Дефицит воды в первую очередь приводит к уменьшению в клетках свободной воды, что изменяет гидратные оболочки белков цитоплазмы и сказывается на функционировании белков-ферментов. В условиях водного дефицита тормозятся клеточное деление и особенно растяжение, что приводит к формированию мелких клеток. При резком недостатке воды в почве задерживается биосинтез органических соединений и усиливается гидролиз, в результате чего нарушаются ростовые процессы (Хван, 1969). Растения, перенесшие сильную кратковременную засуху, так и не возвращаются к нормальному обмену веществ (Boyer, 1982).
Известно, что реализация антистрессовых программ требует больших энергетических трат (Шакирова, 2001). Поэтому энергетический обмен играет важную роль в адаптивных реакциях организма. В своей работе мы обратили внимание главным образом на митохондрии, так как эти органеллы, как у растений, так и у животных играют одну из основных ролей в ответе организма на действие стрессовых факторов.
Около 1-3% потребляемого митохондриями кислорода в результате 1-2-электронного восстановления образует активные формы кислорода (АФК), которые участвуют в клеточной редокс-сигнализации. В норме стационарный уровень АФК в органах и тканях весьма низок (порядка 10-10-10-11 M) за счет наличия в них ферментативной и неферментативной систем регуляции накопления и утилизации АФК. При длительном действии неблагоприятных факторов или сильном воздействии стрессового фактора происходит смещение про-/антиоксидантного равновесия в сторону увеличения продукции АФК митохондриями, что приводит к нарушению физиологических функций растительных организмов (угнетению ростовых процессов, снижению урожайности и т.д.). При этом митохондрии являются как источниками, так и мишенью АФК, способных ингибировать или снижать активность ферментов митохондрий, содержащих Fe-S-кластеры. При этом наиболее чувствительным к продуктам свободно радикальных реакций является I комплекс дыхательной цепи митохондрий (Sweetlove et al., 2002; Paradies, 2004).
Кроме того, взаимодействие АФК с полиненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав липидов мембран митохондрий, такими как линолевая и линоленовая кислоты, приводит к активации пероксидного окисления липидов (ПОЛ). Образование в результате ПОЛ гидрофильных продуктов окисления изменяет структуру липидного бислоя мембран в гидрофобных участках. Пероксидация линолевой кислоты, входящей в состав кардиолипина, вызывает снижение содержания этого фосфолипида во внутренней мембране митохондрий, (Genova, Lenaz, 2014) и окисление тиоловых групп белков. В результате происходит набухание митохондрий, выход цитохрома с и, возможно, индукция апоптоза (Kang et al., 1979; Vladimirov et al., 1980; Zhang, Li et al, 2009). Активация процессов ПОЛ может быть одной из причин утечки цитохрома с и нарушения электрон-транспортной функции цитохромоксидазного участка дыхательной цепи митохондрий (Scott, Logan, 2008; Кашуро и др., 2010).
Влияние дефицита воды, а также других стрессовых факторов, на растение может быть ослаблено или нивелировано обработкой синтетическими регуляторами роста и развития растений (РРР), которые оказывают стабилизирующее действие на биологические мембраны уменьшая их повреждение, либо восстанавливая активность метаболических процессов (Калмыкова и др., 2012). В последние годы большое внимание уделяется синтезу и применению синтетических РРР, которые обладают не только ростостимулирующими, но и адаптогенными свойствами.
В связи с этим можно было предположить, что такие РРР могут повышать устойчивость растений к действию стрессовых факторов, влияя на генерацию АФК митохондриями. В качестве объектов исследования нами были выбраны препараты, относящиеся к различным классам химических соединений: фосфорорганическое соединение – мелафен (меламиновая соль бис (оксиметил)-фосфиновой кислоты, производное 5-гидроксибензимидазола – амбиол: (2-метил-4-диметиламинометил-бензил-имидазол-5-ол-дигидрохлорид) и трициклический германиевый эфир триэтаноламина – герматран 1-(герматран-1-ил)-1-оксиэтиламин, предотвращающие активацию ПОЛ в модельных экспериментах (Жигачева и др., 2008; Zhigacheva, Burlakova, 2014; Жигачева и др. 2015).
Поскольку водный дефицит снижает функциональную активность, как хлоропластов, так и митохондрий (Шугаева и др., 2007), интересно было выяснить, как влияют эти РРР на функциональное состояние митохондрий проростков гороха, подвергнутых двухдневному действию недостаточного увлажнения.
МЕТОДИКА
В работе использовали 6-дневные проростки гороха (Pisum sativum L), сортов Флора 2 и Альфа. Семена гороха промывали водой с мылом и 0,01% раствором КMnO4. Контрольную группу семян в течение 1 ч замачивали в воде, а опытную группу – в растворе исследуемых РРР: 2×10-12 М мелафена, 10-9 М амбиола и 10-5 М герматрана. Эти соединения в указанных концентрациях снижали интенсивность ПОЛ до контрольных значений (Zhigacheva, Burlakova, 2014). После обработки семена переносили на влажную фильтровальную бумагу, где они находились в темноте в течение 2 сут. Через 2 сут половину семян контрольной группы варианта с недостаточным увлажнением (НУ) и обработанные РРР на 2 сут переносили на сухую фильтровальную бумагу. Затем семена группы НУ и семена, обработанные РРР, переносили на влажную фильтровальную бумагу, где они находились в течение последующих 2 сут. Вторая половина семян контрольной группы оставалась на влажной фильтровальной бумаге в течение 6 сут. На шестые сутки выделяли митохондрии из эпикотилей проростков всех исследуемых групп.
Выделение митохондрий из эпикотилей этиолированных проростков проводили методом дифференциального центрифугирования (Попов и др., 2003). Эпикотили гороха длиной 3-6 см гомогенизировали со 100 мл среды выделения, содержащей 0,4 М сахарозу, 5 мМ ЭДТА, 20 мМ КН2РО4 (рН 8,0), 10 мМ КСl, 2 мМ дитиотреитол и 0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА), свободный от жирных кислот (ЖК). Гомогенат центрифугировали при 25000 g в течение 5 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 8 мл среды промывания и центрифугировали при 3000 g в течение 3 мин. Среда промывания содержала: 0,4 М сахарозу, 20 мМ КН2РО4 (рН 7,4), 5 мМ ЭДТА, 10 мМ КСl и 0,2% БСА (свободный от ЖК). Надосадочную жидкость центрифугировали при 11000 g течение 10 мин, осаждая митохондрии. Осадок ресуспендировали в 2-3 мл среды, содержащей: 0,4 М сахарозу, 20 мМ КН2РО4 (рН 7.4), 0,1% БСА (свободный от жирных кислот) и вновь осаждали митохондрии центрифугированием при 11000 g в течение 10 мин.
Регистрацию потребления кислорода митохондриями осуществляли полярографическим методом, используя полярограф LP-7 (Чехия) и кислородный электрод типа Кларка. Стандартная среда инкубации митохондрий содержала: 0,4 М сахарозу, 20 мМ HEPES-Tris-буфер (рН 7,2), 5 мМ КН2РО4, 4 мМ MgCl2, и 0,1% БСА, 10 мМ малат, 10 мМ глутамат.
Уровень пероксидного окисления липидов (ПОЛ) оценивали флуоресцентным методом (Fletcher et al., 1973). Липиды экстрагировали из митохондрий, содержащих 3-5 мг белка, смесью хлороформ-метанол (2:1 по объему). Соотношение митохондрии: смесь хлороформ-метанол – 1:10. Митохондрии гомогенизировали в течение 1 мин в стеклянном гомогенизаторе объемом 2 мл при температуре 10°С, используя стеклянный пестик, затем к смеси добавляли равный объем дистиллированной воды, быстро смешивали и переносили в 12 мл центрифужные стаканы. (Промывание водой было необходимо для удаления флавиновых компонентов, имеющих максимум флуоресценции в области 520 нм). Центрифугировали в течение 5 мин при 600 g. Отбирали 3 мл нижнего (хлороформного) слоя и добавляли 0,3 мл метанола. Регистрацию флуоресценции проводили в десятимиллиметровых кварцевых кюветах на спектрофлуориметре FluoroMax-HoribaYvon GmbH (Германия). В контрольную кювету добавляли 3 мл хлороформа, а затем 0,3 мл метанола. Длина волны возбуждения флуоресценции была 360 нм, испускания – 420-470 нм. Результаты выражали в условных единицах флуоресценции, пересчитанных на мг белка.
Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) получали кислотным метанолизом липидов мембран митохондрий (Carreau, Dubacq, 1979; Wang et al., 2000). 200 мкл митохондрий помещали в специальную пробирку с герметично закрывающейся пробкой, добавляли 5 мл метилового спирта и на 1 ч помещали в морозильную камеру. Затем в пробу добавляли 600 мкл ацетилхлорида и кипятили при перемешивании в течение 1 ч. Дополнительную очистку МЭЖК проводили с помощью тонко-слойной хроматографии на стеклянных пластинках с силикагелем КСК (Россия) (Воинов и др, 1967; Орел, 2007). МЭЖК экстрагировали гексаном, полученные растворы анализировали.
Идентификацию МЭЖК проводили методом хроматомасс-спектрометрии (ГХ-МС) и по величинам индексов удерживания (Golovina, Kuzmenko, 1977). ГХ-МС осуществляли на хромато-масс-спектрометре Hewlett-Packard-6890 c масс-селективным детектором HP-5972. МЭЖК разделяли на капиллярной колонке НР-5МS (30 м × 0,25 мм, слой фазы 0,25 мкм) при программировании температуры от 60 до 285°С со скоростью 5°С/мин. Температура испарителя - 250°С, детектора - 280°С. Масс-спектры получали, в режиме электронного удара при ионизирующем напряжении 70 e.V. и скорости сканирования 1 с на декаду масс в области 40-450 а.е.м.
Количественный состав МЭЖК определяли на хроматографе марки Кристалл 2000М (Россия) с пламенно-ионизационным детектором и кварцевой капиллярной колонкой SPB-1 (50 м - 0,32 мм, слой 0,25 мкм). Анализ МЭЖК проводили при программировании температуры от 120 до 270°С со скоростью 4°С/мин. Температура инжектора и детектора - 270°С; скорость газа-носителя гелия - 1,5 мл/мин. Каждая проба составляла 2 мкл гексанового экстракта. Содержание МЭЖК в образцах рассчитывали как отношение площади пика соответствующей кислоты к сумме площадей пиков, соответствующих найденным МЭЖК.
Рис. 1. Влияние недостаточного увлажнения (НУ), мелафена (МФ), герматрана (ГЕР) и ам-биола (АМБ) на спектры флуоресценции продуктов ПОЛ в мембранах митохондрий пророс-тков гороха сорта Флора 2.
1 – контроль; 2 – НУ + МФ; 3 – НУ + ГЕР; 4 – НУ + АМБ; 5 – НУ.
Индекс двойной связи (ИДС), характеризующий степень ненасыщенности липидов, вычисляли по формуле: ИДС=ΣPjnj/100, где Pj-содержание ЖК (в %), nj-количество двойных связей в каждой кислоте. Также использовали коэффициент ненасыщенности (К) как отношение суммы ненасыщенных ЖК к сумме насыщенных ЖК.
Образцы митохондрий для атомно-силовой микроскопии (АСМ) готовили на полированной силиконовой подложке перед воздушной сушкой митохондрии на подложке фиксировали 2% глутаровым альдегидом в течение 2 мин. с последующей промывкой водой. Исследование проводили на приборе SOLVER P47 SMENA на частоте 150 кГц в полуконтактном режиме, использовался кантилевер NSG11 с радиусом кривизны 10 нм. Некоторые геометрические параметры имиджа митохондрий определяли, используя Image Analysis. Сечение производили на высоте 30 нм. Объем имиджа митохондрий исследуемых препаратов митохондрий соответствовал произведению площади сечения имиджа митохондрии на среднюю высоту данного имиджа в области сечения.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили путем определения средних арифметических и их стандартных ошибок. Достоверность различий между вариантами со значимостью Р ≤ 0,05. Реактивы: карбонат калия, метанол (Merck, Германия), гексан (Panreac, Испания), хлористый ацетил (Acros, Бельгия), сахароза, Трис, FCCP малат, глутамат, ротенон, антимицин А, N,N, N’,N’-тетраметил-п-фениленди-амин (ТМФД), аскорбат (Sigma Aldrich, США), БСА (свободный от жирных кислот) (Sigma, США), HEPES (МР Biomedicals, Германия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Недостаточное увлажнение вызывало активацию свободнорадикального окисления в мембранах митохондрий этиолированных проростков гороха, о чем свидетельствует 3-кратный рост интенсивности флуоресценции продуктов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) (рис. 1).
Полученные результаты согласуются с литературными данными по влиянию дефицита воды на активацию свободнорадикального окисления в мембранах проростков пшеницы (Selote et al., 2004; Miller et al., 2010). Отметим, что обработка семян гороха исследуемыми РРР приводила к снижению интенсивности флуоресценции продуктов ПОЛ. При этом наиболее эффективным был мелафен и наименее эффективным амбиол.
Активация ПОЛ, возможно, могла привести к изменению в жирнокислотном составе мембран. В связи с этим в следующих сериях экспериментов изучали влияние недостаточного увлажнения и РРР на жирнокислотный состав общей липидной фракции мембран митохондрий. Дефицит воды вызывал увеличение относительного содержания насыщенных и уменьшение содержания ненасыщенных жирных кислот (ЖК) в мембранах митохондрий проростков гороха. При этом значительные изменения наблюдались в содержании жирных кислот с 18 атомами углерода. Содержание линолевой кислоты снижалось на 11%, линоленовой – на 19%, а содержание стеариновой кислоты возрастало на 41%. При этом индекс двойных связей ЖК, содержащих 18 атомов углерода, снижался с 1,45±0,02 до 1,28±0,01 (рис. 2), а коэффициент ненасыщенности жирных кислот, содержащих 18 атомов углерода, уменьшался с 23,54±0,07 до 15,15±0,22.
Изменение содержания жирных кислот с 18 атомами углерода вследствие действия обезвоживания наблюдались также в мембранах митохондрий кукурузы, клеток картофеля, мембранах из листьев Arabidopsis thaliana и абрикоса (Leone et al., 1996; Guo, Li, 2002; Gigon et al., 2004). При этом авторы отмечали значительное снижение содержания линолевой и линоленовой кислот и увеличение содержания стеариновой кислоты. Существенные изменения наблюдались и в относительном содержании жирных кислот с 20 углеродными атомами. Так же как и в случае с С18 ЖК, содержание ненасыщенных ЖК уменьшалось, а содержание насыщенных ЖК – увеличивалось: индекс двойных связей снизился с 0,0555±0,001 до 0,0331±0,001 (рис. 3), а коэффициент ненасыщенности ЖК, содержащих 20 атомов углерода, уменьшился с 3,65 ± 0,03 до 1,20 ± 0,16.
Рис. 2. Влияние недостаточного увлажнения и регуляторов роста растений на индекс двойных связей (ИДС) ЖК, содержащих 18 атомов углерода, в липидной фракции мембран митохондрий проростков гороха сорта Флора 2.
Рис. 3. Влияние недостаточного увлажнения и регуляторов роста растений на индекс двойных связей (ИДС) ЖК, содержащих 20 атомов углерода, в липидной фракции мембран митохондрий проростков гороха сорта Флора 2.
Изменения физико-химических свойств мембран митохондрий, вероятно, могли привести к изменениям липидбелковых взаимодействий, а, следовательно, и активности ферментов дыхательной цепи митохондрий. Действительно, дефицит воды вызывал 40% снижение максимальных скоростей окисления НАДH-зависимых субстратов и 30% снижение величины дыхательного контроля при окислении этих субстратов митохондриями проростков гороха (табл. 1).
При этом скорости окисления сукцината снижались всего на 10-15%. Введение в среду инкубации митохондрий 10 мкМ витамина К3 почти восстанавливало скорости транспорта электронов на начальном участке дыхательной цепи, что свидетельствует о снижении активности I комплекса дыхательной цепи в условиях дефицита воды. Нарушение функционирования электрон-транспортной цепи митохондрий в условиях дефицита воды, возможно, обусловлено окислением ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав кардиолипина, главным образом линолевой кислоты, и, следовательно, возможным снижением содержания этого фосфолипида во внутренней мембране митохондрий (Paradies et al., 2004). Подтверждением этому предположению является 2-кратное снижение скоростей транспорта электронов на конечном цитохромоксидазном участке дыхательной цепи митохондрий проростков гороха, находящихся в условиях дефицита воды (рис. 4).
Группа | Состояние 2 | Состояние 3 | Состояние 4 | ДК | FCCP |
Контроль | 20,0±2,5 | 70,0±5,4 | 30,0±2,0 | 2,33±0,01 | 72,0±5,0 |
НУ | 11,8±1,9 | 47,6±3,2 | 38,2±1,0 | 1,25±0,02 | 49,9±4,8 |
НУ+МФ (2×10-12 M) | 20,8±2,1 | 69,0±4,4 | 28,1±1,3 | 2,46±0,03 | 70,2±3,8 |
НУ+Гер (2×10-5 М) | 19,5±1,4 | 71,0±3,1 | 28,4±2,13 | 2,50±0,04 | 78,0±6,4 |
НУ+АБ (10-9 М) | 17,6±2,0 | 52,8±2,1 | 27,0±2,1 | 1,96±0,03 | 57,1±4,4 |
Примечание. Дополнительные добавки: 200 мкМ AДФ, 10-6 М FCCP (карбонилцианид-р-трифторметоксифенил-гидразон).
Рис. 4. Скорости окисления аскорбата в присутствии ТМФД митохондриями пророст-ков гороха (сорт Альфа).
1 – 400 мкМ ТМФД (N,N,N’,N’-тетраметил - р-фенилендиамин); 2 – 600 мкМ цитохром с добавляли в среду инкубации в концентрации 5×10-6 М. Среда инкубации содержала: 0,4 М сахароза, 10 мМ аскорбат, 60 мкМ ротенон, 5 мкМ антимицин А, 0,5 мкМ FCCP (карбонилцианид-р-трифторметоксифенил-гидразон).
Введение в среду инкубации этих митохондрий, 5×10-6 М цитохрома с приводило к восстановлению скоростей окисления пары аскорбат + ТМФД до контрольных значений, что свидетельствует о потере митохондриями части цитохрома с, обусловленной окислением кардиолипина во внутренней мембране этих органелл. В пользу данного предположения также свидетельствуют и данные, полученные методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). АСМ имиджи митохондрий проростков гороха, подвергшихся двухдневному водному дефициту, существенно изменялись и отличались от контрольных образцов. Статистический анализ объема предварительно фиксированных глутаровым альдегидом митохондрий свидетельствует о появлении одиночных, не делящихся митохондрий большего объема в группе проростков, подвергшихся стрессовому воздействию, по сравнению с контрольной группой, что свидетельствовует о набухании митохондрий (табл. 2).
Группа | Среднее значение V, (?м)2 × nm | 95% | -95% |
Контроль | 81,05 | 92,11 | 69,99 |
НУ + МФ | 86,43 | 94,51 | 78,38 |
НУ | 115,13 | 127,23 | 103,03 |
НУ + ГЕР | 87,7 | 95,79 | 79,6 |
Замачивание семян в 2×10-12 М растворе мелафена или 2×10-5 М растворе герматрана предотвращало изменения морфологии митохондрий. Размеры митохондрий приближались к контрольным. При этом происходило снижение содержания продуктов ПОЛ в мембранах митохондрий: интенсивность флуоресценции продуктов ПОЛ снижалась почти до контрольного уровня. Такая обработка предотвращала изменения эффективности окислительного фосфорилирования, обусловленное дефицитом воды, и способствовала сохранению высоких скоростей окисления НАДН-зависимых субстратов в присутствии АДФ или FCCP. Отметим, что обработка семян гороха 10-9 М амбиолом, который слабее влиял на интенсивность ПОЛ в условиях недостаточного увлажнения, почти не оказывала воздействия на биоэнергетические характеристики митохондрий проростков гороха. Максимальные скорости окисления НАДН-зависимых субстратов в присутствии АДФ и FCCP мало отличались от этих показателей у проростков гороха, находящихся в условиях недостаточного увлажнения. Однако эффективность окислительного фосфорилирования увеличивалась: с 1,25±0,02 (НУ) до 1,96±0,02 (НУ+АБ) (табл. 1). Изменения биоэнергетических характеристик митохондрий, по-видимому, связаны с физико-химическим состоянием мембран этих органелл. Мелафен и герматран, предотвращая окисление ненасыщенных С18 ЖК, главным образом линолевой кислоты (рис. 2), которая является одной из основных жирных кислот, входящих в состав кардиолипина, обеспечивали эффективное функционирование дыхательной цепи митохондрий, вероятно, обусловленное формированием суперкомплексов дыхательных переносчиков (Paradies et al., 2004). Амбиол почти не влиял на окисление С18 ЖК в условиях дефицита воды, но предотвращал окисление С20-ненасыщенных ЖК в мембранах митохондрий проростков гороха (рис. 3), что, очевидно, сказалось на эффективности окислительного фосфорилирования.
Известно, что проростки гороха, особенно чувствительны к недостатку влаги. Ранее было показано, что начальные стадии роста проростков более чувствительны к дефициту воды, чем последующие (Генерозова, Шугаев, 2012). В наших экспериментах мы использовали наиболее чувствительные к недостатку влаги двухдневные проростки. Недостаточное увлажнение ингибировало рост проростков (рис. 5), что согласуется с литературными данными. Обработка семян гороха амбиолом, герматраном и мелафеном, предотвращала торможение роста корней в условиях недостаточного увлажнения. При этом длина корней проростков, обработанных мелафеном, была даже в 1,5 раза больше, чем у контрольных образцов. Отметим, что амбиол почти не оказывал влияния на рост побегов, в то время как мелафен и герматран предупреждали торможение роста побегов в условиях дефицита воды.
Рис. 5. Влияние недостаточного увлажнения, мелафена (МФ), герматрана (ГЕР) и амбиола (АМБ) на рост побегов (1) и корней (2) проростков гороха сорта Флора 2.
Рис. 6. Корреляция между длиной побегов проростков гороха сорта Флора 2 и скоростями окисления НАДН-зависимых субстратов в присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования.
Такое различие во влиянии исследуемых РРР на ростовые процессы, по-видимому, связано с различием в содержании ЖК в составе мембран митохондрий проростков гороха, обработанных мелафеном, герматраном или амбиолом. Действительно, между длиной побегов и максимальными скоростями окисления НАДН-зависимых субстратов, а, следовательно, и коэффициентом ненасыщенности С18 ЖК, наблюдалась тесная корреляция с коэффициентом корреляции 0,9316 (рис. 6). В то же время между коэффициентом ненасыщенности С20 ЖК и длиной корней проростков также наблюдалась тесная корреляция с коэффициентом 0,9491 (данные не представлены).
На основании полученных данных можно предположить, что устойчивость растений к водному стрессу определяется антиоксидантной системой клетки, предотвращающей окисление ненасыщенных жирных кислот, содержащих 18 и 20 углеродных атомов. Отметим, что митохондрии прорастающих семян характеризуются относительно низкими скоростями окисления НАДН-зависимых субстратов. Увеличение активности НАДН-зависимых дегидрогеназ активирует энергетические процессы в клетке, что повышает устойчивость растительного организма к изменяющимся условиям окружающей среды (Koster et al., 2003).
Можно предположить, что слабый защитный эффект амбиола в отношении комплекса I дыхательной цепи митохондрий в условиях недостаточного увлажнения связан с окислением ненасыщенных жирных кислот с 18 атомами, углерода, главным образом линолевой кислоты, входящей в состав кардиолипина, в мембранах митохондрий проростков гороха. Его защитное действие в условиях дефицита воды, вероятно, обусловлено предотвращением окисления жирных кислот, имеющих 20 атомов углерода.
Необходимо отметить, что в настоящее время существует множество гипотез относительно механизмов влияния малых и сверхмалых концентраций БАВ. Поскольку амбиол и герматран использовались нами в области так называемых физиологических концентраций (10-5-10-9 М), то можно предположить, что в этой концентрации исследуемые препараты неспецифически встраивались в мембраны митохондрий и взаимодействовали с окружающими фосфолипидами (Пальмина, 2009). Что же касается мелафена, то он использовался в сверх-малой концентрации (2×10-12 M). По нашему мнению, результаты, полученные для мелафена могут быть интерпретированы с точки зрения физико-химического поведения сильно разбавленных растворов препаратов. По данным И.С. Рыжкиной (2009), мелафен в концентрации 10-18-10-4 моль/л образует наноассоциаты с участием воды размером около 200 нм. Концентрационные зависимости, полученные Коноваловым А.И. и его сотрудниками для размеров и электрогидравлического кинетического потенциала (ζ-потенциала) наноассоциатов, образованных в водных растворах мелафена при низких и сверхнизких концентрациях (Рыжкина и др., 2009), сравнимы с биологическим действием препарата, как описано в этой работе и других публикациях (Жигачева и др., 2007; Zhigacheva et al, 2014), что свидетельствует о возможной роли наноассоциатов мелафена в проявлении его биологических эффектов.
ЛИТЕРАТУРА
- Воинов Н.А., Т.Г. Волова-Алимова Е.К, Аствацату-рьян А.Т. Исследование жирных кислот и липи-дов методом хроматографии. – М.: Медицина , 1967 – 289 c.
- Генерозова И.П., Шугаев А.Г. Дыхательный метабо-лизм митохондрий проростков гороха разного возраста в условиях недостатка влаги и реовод-нения // Физиология растений. – 2012. – Т. 59, №2. – С. 262-273.
- Жигачева И.В., Бинюков В.И., Миль Е.М, Генерозо-ва И.П., Расулов М.М. Влияние германийоргани-ческого соединения на функциональное состоя-ние митохондрий растительного и животного происхождения // Научный альманах. – 2015. – Т. 7, № 9. – С. 955-966.
- Жигачева И.В., Фаткуллина Л.Д., Бурлакова Е.Б., Шугаев А.Г., Генерозова И.П., Фаттахов С.Г, Коновалов А.И. Влияние фосфорорганического регулятора роста растений на структурные ха-рактеристики мембран растительного и животно-го происхождения // Биол. мембраны. – 2008 – Т. 25, № 2. – С. 128-134.
- Жигачева И.В., Фаткуллина Л.Д., Русина И.Ф., Шу-гаев А.Г., Генерозова И.П., Фаттахов С.Г., Ко-новалов А.И. Антистрессовые свойства препарата мелафен // Докл. АН [Россия]. – 2007. – Т. 414, № 2. – С. 263-265.
- Калмыкова Т.С., Лукатин А.С., Духовкис П., Кулико-ва Н.Н. Эффект препарата силк в условиях ком-плексного температурного и водного стрессов на растения томатов // С.-х. биология. – 2012. – № 1. – С. 86-91.
- Кашуро В.А, Долго-Сабуров В.Б., Башарин В.А., Бо-нитенко Е.Ю., Лапина Н.В. Некоторые механиз-мы нарушения биоэнергетики и оптимизация подходов к их фармакотерапии // Фармакология. – 2010. – Т. 11. – С. 611-634.
- Орел Н.М. Биохимия липидов. – Минск: БГУ, 2007. – 35 с.
- Пальмина Н.П. Механизм действия сверхмалых доз // Химия и жизнь. – 2009. – № 2. – С. 10-13.
- Попов В.Н., Руге Э.К., Старков А.А. Влияние инги-биторов электронного транспорта на образова-ние активных форм кислорода при окислении сукцината митохондриями гороха // Биохимия. – 2003. – Т. 68, № 7. – С. 910-916.
- Рыжкина И.С., Муртазина Л.И., Киселева Ю.В., Коновалов А.И. Свойства супрамолекулярных наноассоциатов, образующихся в водных рас-творах низких и сверхнизких концентраций био-логически активных веществ // Докл. АН [Рос-сия]. – 2009. – Т. 428, № 4. – С. 487-491.
- Хван А.В. Влияние недостаточного и избыточного увлажнения почвы на некоторые физиологиче-ские показатели и урожай сои // Вопросы биоло-гии. – Благовещенск, 1969. – С. 104-116.
- Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция. – Уфа: Гилем, 2001. – 160 с.
- Шугаева Н.А., Выскребенцева Э.И., Орехова С.О., Шугаев А.Г. Влияние водного дефицита на ды-хание проводящих пучков листового черешка сахарной свеклы // Физиология растений. – 2007. – Т. 54, № 3. – С. 373-380.
- Boyer J.S. Plant productivity and the environment // Science. – 1982. – V. 218. – P. 4430-448.
- Sweetlove L.J., Heazlwood J.L., Hearld V., Holtzap-ffel R., Day D.A., Leaver C.J., Millar A.H. The im-pact of oxidative stress on Arabidopsis mitochondria // Plant J. – 2002. – V. 32. – P. 891-904.
- Carreau J.P., Dubacq J.P. Adaptation of macroscale method to the microscale for fatty acid methyl trans-esterification of biological lipid extracts // J. Chro-matogar. – 1979. – V. 151. – P. 384-390.
- Fletcher B.I., Dillard C.D., Tappel A.L. Measurement of fluorescent lipid peroxidation products in biological systems and tissues// Anal. Biochem. – 1973. –V. 52. – P. 1-9.
- Genova M.L., Lenaz G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes // Biochim. Biophys. Acta. – 2014. – V. 1837. – P. 427-443.
- Gigon A., Matos A.R., Laffray D., Zuily-Fodil Y., Pham-Thi A.T. Effect оf drought stress on lipid metabo-lism in the leaves of Arabidosis thaliana (Ecotype Columbia) // Ann. Bot. – 2004. – V.94, № 3, – P. 345-351.
- Golovina R.V., Kuzmenko T.E. Thermodynamic evalua-tion interaction of fatty acid metyl esters with polar and nonpolar stationary phases, based on their reten-tion indices chromatographia // Сhromatogr. – 1977. – V.10. – P. 545-546.
- Guo Y.P., Li J.R. Changes of Fatty Acids composition of membrane lipids, ethylene release and lipoxygen-ase activity in leaves of apricot under drought // J. Zhejiang Univ (Agricalt. Life Sci). – 2002. – V. 28. – P. 513-517.
- Kang S.Y., Gutowsky H.S., Hsung J.C., Jacobs R., King T.E., Rice D., Oldfield E. Nuclear magnetic resonance investigation of the cytochrome oxidase--phospholipid interaction: a new model for boundary lipid // Biochemistry. – 1979. – V. 18. – P. 3257-3267.
- Koster K.L., Reisdorph N., Ramsau J.L. Changing des-iccation tolerance of pea embryo protoplasts during germination // J. Exp. Bot. – 2003. – V. 54. – P. 1607-1614.
- Leone A., Costa A., Grillo S., Tucci M., Horvarth I., Vigh L. Acclimation to low water potential deter-mines changes in membrane fatty acid composition and fluidity in potato cells // Plant Cell Environ. – 1996. – V. 19. – P. 1103-1109.
- Miller G, Suzuki N, Ciftci-Yilmaz S, Mittler R. Reactive oxygen species homeostasis and signaling during drought and salinity stresses// Plant Cell Environ. – 2010. – V. 33. – P. 453-467.
- Paradies G., Petrosillo G., Pistolese M., Venosa N., Federici A., Ruggiero F.M. Decrease in mitochon-drial complex I activity in ischemic/perfused rat heart. involvement of reactive oxygen species and cardiolipin // Circul. Res. – 2004. – V. 94. – P. 53-59.
- Scott I., Logan D.C. Mitochondria and cell death path-ways in plants // Plant Signal Behav. – 2008 – V. 3 – P. 475-477.
- Selote D.S., Bharti S., Khanna-Chopra R. Drought ac-climation reduces O2•- accumulation and lipid pe-roxidation in wheat seedlings // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2004. – V. 314. – P. 724-729.
- Vladimirov Yu.A., Olenev V.I., Suslova T.V., Chere-misina Z.V. Lipid peroxidation in mitochondrial membrane // Adv. Lipid Res. – 1980. – V. 17. – P. 173-249.
- Wang J., Sunwoo H., Cherian G., Sim I.S. Fatty acid de-termination in chicken egg yolk. A comparison of different methods poultry // Science. – 2000. – V. 79. – P. 1168-1171.
- Zhang L., Li Y., Xing D., Gao C. Characterization of mi-tochondrial dynamics and subcellular localization of ROS reveal that HsfA2 alleviates oxidative damage caused by heat stress in Arabidopsis // J. Exp. Bot. – 2009 – V. 60. – P. 2073-2091.
- Zhigacheva I.V., Burlakova E.B. Chapter 13. Adap-togenes and plant growth regulators decrease the generation of ROS in mitochondria // Chemistry and Physics of Complex Material. – London; New-York: Apple Academic Press, 2014 – P. 466-482.
- Zhigacheva I., Mil’ E., Binukov V., Generozova I., Shugaev A., Fatkullinа L. Combined effect of insuf-ficient watering, moderate cooling, and organophos-phorous plant growth regulator on the morphology and functional properties of pea seedling mitochon-dria // Ann. Res. Rev. Biol. – 2014 – V. 4. – P. 3007-3025.